亲代HCC827细胞的埃罗替尼敏感性。该效果对于miR-34a序列是特异性的，因为阴 性对照miRNA(miR-NC)的加入并没有改善埃罗替尼的效能（图4C)。因此，在HCCS〗?1'，田 胞中产生的数据表明，miR-34a可以使具有获得性埃罗替尼抗性的癌细胞致敏。
[0113] 为了确定所述miRNA是否还能抵消原发性抗性机制，我们使用在NRAS和TP53基 因中具有突变的H1299细胞。在这些细胞中，埃罗替尼产生了ΙΙ.ΟμΜ的IC5。值（图4D)。 通过与0. 3nMmiR-34a组合，埃罗替尼的剂量-响应曲线沿X轴移动，表明约低4倍的IC5。 值（3. 0μΜ)。该结果与未改变埃罗替尼的效能的miR-NC相反，并表明miR-34a使具有获得 性以及原发性抗性的非小肺癌细胞致敏。
[0114]miR_34a和埃罗替尼在非小细胞肺癌细胞中协同作用
[0115] 埃罗替尼IC5。值的位移表明固定的miR_34a浓度如何能提高埃罗替尼的效能。 然而，这种模型，也被称为"固定浓度模型"，不允许对协同作用的评估。为了研究这两种 药物是否可以彼此强化，我们采用了基于Loewe的加和性概念的"固定比例模型"（Chou TC(2010)Drugcombinationstudiesandtheirsynergyquantificationusingthe Chou-Talalaymethod.CancerRes70:440-6.TallaridaRJ(2001)Drugsynergism:its detectionandapplications.JPharmacolExpTher298:865-72.TallaridaRJ(2006) Anoverviewofdrugcombinationanalysiswithisobolograms.JPharmacolExpTher 319:1-7)。在该模型中，根据各剂量-响应曲线（单独或组合的药物）的斜率和IC5。值来计 算组合指数（CI)值，并确定药物-药物相互作用是否是协同性的（CI〈1)、加和性的（CI= 1)或拮抗性的（CI>1)。由于CI值的准确度依赖于剂量-响应曲线趋势线的拟合，因此通 过使用线性或非线性回归趋势线的两种方法来计算CI值（参见材料与方法部分）。使用四 种埃罗替尼抗性细胞系，所有这些细胞系在它们的遗传组成上不同：A549(在KRAS、STK11、 〇)謂2厶中突变）、!1460(在1(狀5、51'1(11、〇)謂2厶、？11(30厶中突变）、!11299(在~狀5、了？53中 突变）和H226 (在CDKN2A中突变）[37]。qRT-PCR分析显示了AXL、GAS6 和FGFRlmRNA水 平在这些细胞中相对于在对埃罗替尼敏感的HCC827细胞中的显著增加，从而进一步提供 了对埃罗替尼抗性的解释（图8A-C)。miR-34的水平在H1299和H460细胞中显著降低。 在第一步中，将埃罗替尼或miR34a以系列稀释添加至细胞中，以确定每种药物单独的IC5。 值。对于埃罗替尼，其范围为4.2至>50以1(图94-8)。1^1?34 &的1(：5。值的范围为0.4至 15. 6nM。没有药物能够达到100%癌细胞抑制，而且任何药物的最大活性也不超过75%。 埃罗替尼和miR-34a在H226细胞中效果最差，产生了作为剂量-响应曲线的外推结果的 理论IC5。值。在第二步中，每种药物以等于它自己的近似IC5。值以及在其以上及以下的倍 数（固定比例）的浓度进行组合。作为对照，每种药物在这些浓度下单独使用。线性和非 线性回归模型均产生了在所有测试的细胞系中远低于1. 0的CI值，显示了强协同作用（图 5A)。我们认为相关的CI值是那些低于0. 6的值。在大多数细胞系中，在较高的剂量水平 和较高的癌细胞抑制量级下观察到协同作用。由于药物组合的实际应用需要在最大癌细胞 抑制（75%或更高的抑制）下协同作用，因此这是至关重要的。通常，非线性回归趋势线提 供了对实际数据的更好的拟合，尽管这两个模型均产成了相似的结果。
[0116] 接着，我们生成了等效线图并确定了作为协同作用的读出的每种药物在50%和 80%癌细胞抑制下的剂量需要。选择50%的效应水平是因为经常在药物的IC5。下评估药 物的效能以及因为在我们的研究中每种药物单独均能够将大多数癌细胞抑制50%，从而允 许每种单独的药物与组合在实际数据范围内比较。选择80%效应水平是因为对于肿瘤学应 用证明在高抑制活性下的协同作用是重要的。虽然每种药物单独达到80%抑制时的浓度 是基于剂量-响应曲线的外推并且在本质上是理论性的，但miR-34a-埃罗替尼组合容易达 到80%或更高的抑制并在实际数据的范围内。由于两种药物本身在H226细胞中并不十分 有效，因此针对H226数据生成在30%和50%抑制下的等效线图。如图5B所示，组合的等 效线远低于每个细胞系的加和等效线和效应水平，表明强协同作用。在大多数细胞系中埃 罗替尼的剂量要求降低至2μΜ或更低以达到50%抑制，从而将剂量减少了 4至46倍。同 样地，相对于单独的miR-34a，在组合中所需miR-34a的浓度也大幅较少，其剂量降低了 7至 13倍。这种剂量水平的减少（也被称为剂量减少指数（DRI))在80%抑制下是明显的，在 80%抑制下剂量需求降低了高达28倍（埃罗替尼）和33倍（miR-34a)。
[0117] 第三，我们进行了曲线位移分析，由此将每种药物的浓度对它自己的IC5。值进 行归一化（ZhaoL,AuJLWientjesMG(2010)Comparisonofmethodsforevaluating drug-druginteraction.FrontBiosci(Elite编著）2:241_9·)。药物浓度到IC5。等效量 (IC5。等效）的这种转化允许直接比较来自单一药剂和组合的每个剂量-响应曲线。生成了 趋势线并且其跨越了 0-100%抑制的效应水平。趋势线的斜率表示药物效能，而最大活性可 由实际数据点来度量。当组合的IC5。等效量较低时确定协同作用以达到相对于单一药剂的 任何给定效应（见上）。这在视觉上通过组合趋势线的左移来指示。如图8A-C中所见，所 述组合与单一药剂良好分离，显示了协同作用。在H460和H226细胞中，与单一试剂的IC5。 等效量相比，该组合的IC5。等效量在低效应水平（0-25% )下较大而在30%以上效应水平 下较低。这一观察结果与来自CI曲线的数据一致，该曲线显示在这些细胞中在25 %抑制以 下为拮抗作用而25%抑制以上为协同作用（图4A)。因此，所述分析揭示了诱导高水平的 癌细胞抑制的药物浓度的协同效应。通过以下事实进一步证明了组合的益处：相对于单一 药剂，组合的实际抑制水平更大一一单一药物的最大活性不超过75%，并且在联合使用时 可以扩展至超过90%。
[0118] 各种比例的埃罗替尼和miR_34a协同配合
[0119] 我们的分析表明埃罗替尼和miR_34a在以由它们的IC5。值获得的比例组合时，这 两种药物协同作用。因为药物-药物相互作用可以根据相对量而改变，因此我们通过将浓 度为0. 41-100μΜ的埃罗替尼与浓度为0. 12-30nM的miR-34a组合起来而探索了多个埃罗 替尼-miR-34a比例的效果。药物剂量以2. 5倍的增量提高，并且每种药物还作为对照单独 使用。该矩阵产生了表示13种不同的药物比例的49种药物组合（图6A)。测定每个组合 的癌细胞抑制水平、CI和DRI值并绘制在CI图、等效线图和曲线位移图中。在该实施例中， 我们关注其中miR-34a和埃罗替尼以IC5。:IC5。比值（摩尔比1:3333)以及下面的基于摩 尔的比值添加的组合：1:533、1:1333、1:8333和1:208333。
[0120] 计算的CI值预测，以全部这些比例组合的埃罗替尼与miR_34a提供了强协同作用 (图6B)。效应水平大于75%抑制时，CI值低于0. 2。含有较多量的埃罗替尼的比例提供 了在低于约75%的效应水平下的较低的协同作用，并在75%抑制以上的效应水平下略微 较优。类似地，等效线图显示了各种埃罗替尼-miR_34a比例的强协同作用（图6C)。实际 数据点表明，当用作单一药剂时需要30nM的miR-34a或100μΜ的埃罗替尼来诱导约80% 的癌细胞抑制。相比之下，随着miR-34a的量增加，组合中所需的埃罗替尼的剂量水平大幅 降低。例如，当与12nMmiR34a-起使用时仅需要2. 56μΜ的埃罗替尼来诱导约80%的抑 制，从而将埃罗替尼的剂量需求降低了约40倍。针对这些比例的协同作用的进一步证据来 自曲线位移分析，该分析揭示了与单独的单一药剂的IC5。值相比低得多的组合的1C5。等效 量（图6D)。IC5。等效量数据与CI数据相关，CI数据显示了各种比例之间协同作用的剂量 依赖度：低比例显示了在低效应水平下较低的协同作用，这与在高水平的癌细胞抑制下的 情形相反。
[0121] 全部范围的49种组合还在H1299、H460和H226细胞中进行测试并确认了采用 A549细胞获得的结果（图10A-D)。多个比例提供了良好的协同作用，并且具有更高效能 的那些比例聚类到具有更高药物浓度的那些比例。这些比例中很多满足我们的截断值 (cut-off)，并针对每种药物产生了 >75 %的癌细胞抑制、CI〈0. 6和DRI>2。
[0122] 埃罗替尼和miR_34a在肝细胞癌细胞中协同配合
[0123] 为了研究埃罗替尼和miR_34a的协作活性是否在其他癌症适应证中有用，我们 在肝细胞癌的细胞模型中对这一组合进行了探测。选择肝癌作为测试平台，这是因为 埃罗替尼作为单一药剂剂在晚期肝癌患者中适度有效，并且与索拉非尼组合时没有延 长总存活率和疾病进展时间（time-to-progression)(PhilipPA,MahoneyMR,Allmer C,ThomasJ,PitotHC等人（2005)PhaseIIstudyofErlotinib(0SI_774)inpatients withadvancedhepatocellularcancer.JClinOncol23:6657-63.ThomasMB,Chadha R,GloverK,WangX,MorrisJ等人（2007)Phase2studyoferlotinibinpatients withunresectablehepatocellularcarcinoma.Cancer110:1059-67.ZhuAX,Rosmorduc 0,EvansJ,RossP,SantoroA等人（2012)SEARCH:AphaseIII,randomized,double-b lind,placebo-controlledtrialofsorafenibpluserlotinibinpatientswith hepatocellularcarcinoma(HCC).第37届欧洲肿瘤医学学会年会（37thAnnualEuropean SocietyforMedicalOncologyCongress)，Vienna,Austria, 9月 28 日-10月 2 日（abstr 917))〇
[0124] 此外，MRX34--目前处于临床试验中的miR_34a脂质体，在临床前动物研究中有 效地消除了肝肿瘤并因此可能是与埃罗替尼组合的具有吸引力的药剂。使用的细胞模型包 括Η印3B、C3A、HepG2和Huh7,其中几个与埃罗替尼敏感性肺癌系相比表现出埃罗替尼抗 性基因AXL、HGF、FGFR1和ERBB3的上调（图11)。总体上，miR-34家族成员的水平在肝癌 细胞中是低的或不可检测的。与我们的预期一致，在这四种细胞系中埃罗替尼的IC5。值为 25μΜ或更大（图12A-B)。miR-34a的IC5。值的范围为0. 3至2. 3nM，并因此类似于肺癌细 胞中的那些值。使用这些值作为指导来以固定的IC5。:IC5。比例组合埃罗替尼与miR-34a以 及用于产生CI、等效线和IC5。等效值（图7)。此外，每个组合还在不同浓度的矩阵中进行 测试以评估在多个比例上的组合效果（图13A-D)。我们的数据预测在全部测试的细胞系 中埃罗替尼与miR-34a之间具有强协同作用。在高水平的癌细胞抑制下观察到协同作用， 因此协同作用在所希望的活性范围内发生（图7A)。该结果通过IC5。等效曲线位移分析得 到确认，表明在较高剂量和效应水平下的协同作用。该分析还表明该组合的最大抑制活性 与单一药剂的最大抑制活性相比大幅增加（图7C)。等效线图表明，当与miR34a-起用于 诱导50%或更高的抑制如80%时，埃罗替尼剂量明显减少（图7B)。在组合中，可使用浓 度低至2μΜ的埃罗替尼来将癌细胞抑制50%，从而使它的剂量与单独使用相比降低75倍 (参见!fepG2)。协同作用不限于特定的比例，但是在大多数所测试的比例中是明显的（图 13A-D)。因此，该数据类似于在肺癌细胞中生成的数据，并预测在单独的埃罗替尼没有足够 效果的癌症中，埃罗替尼_miR34a组合的增强的功效。
[0125] 讨论
[0126] 药物-药物相互作用的准确评价是复杂的，因为结果取决于药物比例、药物 浓度和所需效能（ChouTC(2010)Drugcombinationstudiesandtheirsynergy quantificationusingtheChou-Talalaymethod.CancerRes70:440-6)。为了石开究 miR-34a模拟物与埃罗替尼之间的药理关系，我们使用多种分析方法来揭示药物增强作用 ("固定浓度"模型）以及区分加和性、拮抗作用和协同作用（"固定比例"模型）。我们 考察了CI值、等效线图和来自线性和非线性数据回归的IC5。等效量。我们的数据显示， miR-34a增强了在测试的所有癌细胞中对埃罗替尼的敏感性一一无论它们是否与原发性或 继发性/后天性抗药性有关。一个看似合理的解释由肿瘤抑制基因miRNA抑制许多癌症 途径的事实提供。以下事实支持了这一假设，AXL和MET(与埃罗替尼抗性特异性关联的基 因产物）直接被miR_34a抑制（KallerM，LiffersST，OeljeklausS，KuhlmannK，RohS等人（2011)Genome-widecharacterizationofmiR_34ainducedchangesinprotein andmRNAexpressionbyacombinedpulsedSILACandmicroarrayanalysis.Mol CellProteomics10:M111 010462.MudduluruG,CeppiP,KumarswamyR,Scagliotti GV,PapottiM等人（2011)RegulationofAxlreceptortyrosinekinaseexpressionby miR-34aandmiR-199a/binsolidcancer.Oncogene30:2888-99.HeL,HeX,LimLP,de StanchinaE,XuanZ等人（2007)AmicroRNAcomponentofthep53tumoursuppressor network.Nature447:1130-4)〇
[0127] 出乎意料地，埃罗替尼还增强了miR_34a模拟物的治疗效果，尽管现有的证据 暗示miR_34a控制多种致癌信号途径，包括EGFR途径（LaiA,ThomasMP,Altschuler G,NavarroF, 0'DayE等人（2011)CaptureofmicroRNA-boundmRNAsidentifiesthe tumorsuppressormiR_34aasaregulatorofgrowthfactorsignaling.PLoSGenet 7:el002363)。因此，该结果表明，miRNA模拟物可与单一基因定向治疗协同作用，并引起对 于其他组合的搜索。因此，在各种另外的实施方案中，本发明包括miR-34a与其他EGFR抑 制剂如吉非替尼、阿法替尼、帕尼单抗和西妥昔单抗以及HER2抑制剂如拉帕替尼、帕妥珠 单抗和曲妥珠单抗的组合。
[0128] 在具有获得性抗药性的肺癌细胞（HCC827ras)中，添加少量的miR_34a能够将埃罗 替尼IC5。值降低至低于0.ΙμΜ。这是一个值得注意的结果，并且表明miR-34a可使该细胞 系与亲代HCC827细胞相比同样地对埃罗替尼敏感。在具有原发抗性的肺癌细胞中，埃罗替 尼的IC5。剂量需求降低了 4至46倍，并且约为2μM。这可能在具有临床效用的浓度范围之 内（SharmaSV,BellDW，SettlemanJHaberDA(2007)Epidermalgrowthfactorreceptor mutationsinlungcancer.NatRevCancer7:169_81)。埃罗替尼每日给药，口服剂量最 高达150mg。虽然MRX34的临床剂量水平还没有被确定