用于组织再生的包含胶原和prp的组合物的制作方法
【技术领域】 [0001] 和【背景技术】
[0002] 本发明，在其一些实施方案中，涉及用于组织再生并且，更特别地，但不完全用于 软组织再生的包含胶原和富血小板血浆（PRP)的组合物。
[0003] 富血小板血浆（PRP)是富集血小板的血浆。作为自体血小板的浓缩来源，PRP含 有（并且通过脱粒释放）几种不同的生长因子和刺激骨和软组织愈合的其它细胞因子。
[0004] 随着血小板通过经由α-颗粒脱粒释放局部作用生长因子而引发伤口修复，PRP 起到组织封闭剂和药物递送系统的作用。血小板的α-颗粒中所含的分泌蛋白包括血小板 源生长因子（PDGF-AA、BB和ΑΒ异构体）、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板因子4 (PF4)、 白细胞间素-l(IL-l)、血小板源血管生成因子（PDAF)、血管内皮生长因子（VEGF)、上皮生 长因子（EGF)、血小板源内皮生长因子（PDEGF)、上皮细胞生长因子（ECGF)、胰岛素样生长 因子（IGF)、骨钙素（0c)、骨粘连蛋白（On)、纤维蛋白原（Ff)、玻连蛋白（Vn)、纤连蛋白 (Fn)和血小板反应蛋白-l(TSP-l)。这些生长因子通过吸引新形成的基质中的未分化细胞 并触发细胞分裂而帮助愈合。PRP可抑制细胞因子释放并限制炎症，与巨噬细胞相互作用以 提高组织愈合和再生，促进新毛细血管生长，并加速慢性伤口中的上皮形成。
[0005] PRP中的血小板通过生成吸引巨噬细胞的信号蛋白在伤口部位的宿主防御机制 中也起作用；PRP也可含有少量合成作为非特异性免疫反应的一部分的白细胞间素的白细 胞。
[0006] PRP向损伤部位的递送和滞留由于其液体状态并且因此物质可能向周围组织损失 而仍然是一个挑战。凝血酶（主要为牛源性）是用于凝块形成和增加PRP胶凝化的常见血 小板活化因子。凝血酶的使用具有几个缺点。凝血酶在人类中具有不良免疫反应。另外，体 外研究已显示出对细胞增殖和活力的抑制（LawsonJH.SeminThrombHemost，2006 ;32(增 刊 1)98-110;MurrayMM等，JOrthopRes. 2007 35(1)第 81-91 页）。
[0007] 发现天然介入内在凝血级联的I型胶原是用于血小板活化的凝血酶的有吸引力 的替代物。除了是哺乳动物结缔组织中的主要蛋白组分外，I型胶原是研究最多的用于再 生医学和组织工程学的天然支架。
[0008] 几项体外研究调查了从受凝血酶或胶原活化的PRP凝块的细胞因子释放以便表 征其释放曲线（TsayRC等，JOralMaxillofacSurg，2005 63 第 521-528 页；FufaD等， JOralMaxillofacSurg，2008 66(4)第684-690页）。经证实呈不同物理状态、可溶或原 纤维的I型胶原在几天内刺激TGF、PDGF和VEGF的释放与凝血酶一样有效。培育经凝血酶 或I型胶原活化的PRP的培养物长达15天并且证实基于胶原的凝块在大部分基于凝血酶 的凝块降解时保持其初始形状和尺寸。
[0009] Laci等，YaleJBiolMed. 2010March;83(1) :1 -9 教导称氯化钙可用于活化PRP 凝块。
[0010] 美国专利申请第20120201897号教导了用于活化PRP凝块的氯化钙和I型胶原的 组合。
【发明内容】
[0011] 根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种包含交联胶原、富血小板血浆 (PRP)和无机盐的物质组合物。
[0012] 根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种包含胶原、富血小板血浆（PRP) 和无机盐的物质组合物，其在37°C下培育10天后能够释放超过4000pg/ml的血小板源生长 因子（TOGF)。
[0013] 根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗伤口 或诱导组织再生的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的物质组合物， 从而治疗所述伤口或诱导组织再生。
[0014] 根据本发明一些实施方案的一个方面，提供了一种生成用于治疗伤口或诱导组织 再生的物质组合物的方法，其包括：
[0015] (a)生成胶原和无机盐的混合物；并且
[0016] (b)使所述混合物与PRP接触，从而生成用于治疗伤口或诱导组织再生的所述物 质组合物。
[0017] 根据本发明的一些实施方案，所述无机盐选自钠盐、氯盐、钾盐、钙盐、镁盐、磷酸 盐、硫酸盐和羧酸盐。
[0018] 根据本发明的一些实施方案，所述无机盐选自NaCl、KC1、CsCl、CaCl2、CsF、KC104、 NaNOjPCaSO4。
[0019] 根据本发明的一些实施方案，所述无机盐为CaCl2。
[0020] 根据本发明的一些实施方案，所述物质组合物呈液态。
[0021] 根据本发明的一些实施方案，所述物质组合物呈半固态。
[0022] 根据本发明的一些实施方案，所述物质组合物可缝合。
[0023] 根据本发明的一些实施方案，所述胶原包含人胶原。
[0024] 根据本发明的一些实施方案，所述胶原包含I型胶原。
[0025] 根据本发明的一些实施方案，所述胶原包含原纤化胶原。
[0026] 根据本发明的一些实施方案，所述胶原包含重组胶原。
[0027] 根据本发明的一些实施方案，所述重组胶原在植物中生成。
[0028] 根据本发明的一些实施方案，所述胶原以约10_50mg/ml的浓度存在。
[0029] 根据本发明的一些实施方案，所述胶原以约20-30mg/ml的浓度存在。
[0030] 根据本发明的一些实施方案，所述氯化钙以约7_60mM的浓度存在。
[0031] 根据本发明的一些实施方案，所述物质组合物能够在37°C下在约6-7分钟内产生 凝块。
[0032] 根据本发明的一些实施方案，所述凝块可缝合。
[0033] 根据本发明的一些实施方案，所述组合物在37°C下培育30天后耐降解。
[0034] 根据本发明的一些实施方案，所述受试者具有腱或骨疾病。
[0035] 根据本发明的一些实施方案，所述组织为腱或骨。
[0036] 根据本发明的一些实施方案，所述物质组合物用于在受试者中治疗伤口或诱导组 织再生。
[0037] 根据本发明的一些实施方案，所述无机盐选自钠盐、氯盐、钾盐、钙盐、镁盐、磷酸 盐、硫酸盐和羧酸盐。
[0038] 根据本发明的一些实施方案，所述无机盐选自NaCl、KC1、CsCl、CaCl2、CsF、KC104、 NaNOjPCaSO4。
[0039] 根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括在所述接触之前干燥所述混合物。
[0040] 根据本发明的一些实施方案，通过原纤化重组胶原溶液获得所述胶原。
[0041] 根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括在所述原纤化之后交联所述胶原。
[0042] 根据本发明的一些实施方案，所述干燥包括冷冻-干燥。
[0043] 根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括在所述接触之前用水合溶液水合所 述干燥之后的所述混合物。
[0044] 根据本发明的一些实施方案，所述水合溶液包含贫血小板血浆（PPP)。
[0045] 根据本发明的一些实施方案，所述交联通过使所述胶原与EDC或DHT接触而实现。
[0046] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语均具有本发明所属领域 中普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然在本发明实施方案的实践或试验中可使用与 本文所述类似或等效的方法和材料，但是下面描述的是示例性方法和/或材料。如有冲突， 以专利说明书，包括定义为准。另外，所述材料、方法和实例仅为说明性而非旨在为必要性 限制。
【附图说明】
[0047] 本文仅以举例的方式，参考附图描述了本发明的一些实施方案。现详细地具体参 考附图，强调所示细节仅举例而言并且是为了说明性讨论本发明实施方案的目的。就这一 点而言，随附图所做的描述使得对于本领域中的技术人员而言可如何实践本发明的实施方 案显而易见。
[0048] 图中：
[0049] 图1为根据本发明的示例性实施方案，通过使用两个注射器混合PRP的装置的照 片。一个注射器装有水合胶原的悬浮液。另一个注射器装有PRP。通过用卢尔锁（luer lock)连接两个注射器进行混合。
[0050] 图2A-D为基于凝血酶-PRP的凝块（A、B)和基于rh胶原-PRP的凝块（C、D)的 SEM图像。比例尺10μm。可以观察到血小板细胞成分形成截留在原纤维成分（纤维蛋白） 之间的细胞聚块。rh胶原纤维被截留在纤维蛋白成分中。
[0051] 图3A-B说明了凝块形成10天后来自于两种类型的rh胶原制剂（交联原纤化胶 原和非交联原纤化胶原）相对于受CaCl2活化的PRP和自活化型PRP(A)及来自于30mg/ml 交联rh胶原相对于受凝血酶活化、受CaCl2活化的PRP和自活化型PRP(B)的TOGF生长因 子的体外累积释放曲线。
[0052] 图4为与凝血酶+PRP和PBS+CaCl2+PRP的对照相比基于rh胶原的凝块的剪应 力-应变曲线。通过rh胶原薄片与CaCl2+PRP直接混合（胶原直接混合）或通过首先用 PBS水合rh胶原薄片，然后与CaCl2+PRP混合（经由PBS的rh胶原）获得两种类型的基于 rh胶原的凝块。
[0053] 图5A-B为说明2天（图5A)和12天（图5B)后与基于凝血酶的凝块（蓝色圆 圈）相比，基于rh胶原的凝块的降解测定的体内结果的照片。可清楚地观察到基于凝血酶 的凝块完全降解。基于rh胶原的凝块在相同时间段内保持稳定。
[0054] 图6A-B说明了接种3和7天后nHDF细胞增殖的结果。图6A表示通过使用WST染 色检测到的定量增殖。图6B展示了对于30mg/ml原纤维、30mg/ml原纤维交联胶原的凝块 样品及基于CaCljPPBS+PRP(无rh胶原）的混合物的凝块而言，3和7天后在transwell 周围增殖的细胞的显微镜检查。
【具体实施方式】
[0055] 本发明，在其一些实施方案中，涉及用于组织再生并且，更特别地，但不完全用于 软组织再生的包含胶原和富血小板血浆（PRP)的组合物。
[0056] 在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明在其应用上不一定限 于以下描述中提出或通过实施例举例说明的细节。本发明能够有其它实施方案或以各种方 式实践或实施。
[0057] PRP是具有浓缩血小板的血浆。在PRP中发现的血小板高度浓缩并且包含生长因 子，以及大量对激活和加速组织修复和再生至关重要的生物活性蛋白。生物活性蛋白增加 了引发结缔组织的愈合、骨再生和修复、新血管的促进和伤口愈合过程的刺激的干细胞的 产生。
[0058] 除非经由凝血机制实现胶凝化，否则呈液体形式的PRP施加于伤口部位可伴有 PRP大量损失到周围间隙中。目前使用牛凝血酶实现胶凝化。
[0059] 虽然牛凝血酶是有效的血小板活化因子，但是也引起抗凝血酶、凝血酶原、因子V 和心磷脂的抗体发展，及在动物研究中作为结果而发生的范围从严重术后出血到类似于狼 疮的自身免疫综合征的临床问题。使用牛凝血酶还导致成纤维细胞通过胶原-PRP凝块的 迀移受损，以及凝块的强度受损。另外，用凝血酶-活化凝块所见的高度凝缩使其难以用于 伤口-间隙填充应用。
[0060] 本发明人提出使用胶原作为PRP的活化因子，由此配制胶原以便控制生长因子从 凝块释放的速率。例如，如图3A-B所示，本发明人证实与使用非交联胶原活化PRP凝块时 相比，当使用交联胶原活化PRP凝块时释放更多的血小板源生长因子（PDGF)。另外，本发明 人提出可向制剂中添加氯化钙以控制凝块形成所需的时间。
[0061] 虽然为实践而简化了本发明，但是本发明人已经证实胶原在PRP凝块中起填料的 作用，由此胶原纤维被截留在凝块的纤维蛋白成分中（图2A-B)。有人提出胶原使纤维蛋白 成分相互连接的能力是造成凝块强度和可缝合性的原因。
[0062] 因此，根据本发明的一个方面提出了一种包含交联胶原、富血小板血浆（PRP)和 氯化钙的物质组合物。
[0063] 如本文中所用，短语"富血小板血浆"是指血小板的浓度高于外周血液的血浆。虽 然正常血小板计数范围可从约140, 000至约400, 000个/微升，但是PRP的一些血小板浓 度可在约500, 000至约1，200, 000/微升或更高的范围内。PRP可由全血形成，并且可使用 自体、异体或混合的血小板和/或血浆来源获得。PRP可由多种动物来源，包括人类来源形 成。
[0064] 通常，PRP可含有95%血小板与