4%红血细胞和1%白血细胞。
[0065] 在一些实例中，PRP可经进一步加工，包括但不限于去白细胞和免疫吸附。其它 PRP组合物在2003年4月11日提交的Mishra的美国专利第6,811,777号中有进一步描 述，其特此通过引用整体并入本文。
[0066] 可使用标准程序从患者抽取全血。
[0067] 全血在采集后可能或可能不经冷却。血小板从全血中的分离依赖于血小板和红血 细胞之间的密度差。血小板和白血细胞浓缩于介于去血小板血浆（上层）和红血细胞（下 层）之间的层中（即，"血沉棕黄层"）。例如，下部浮体和上部浮体可用于将富血小板层截 留在上下相之间。然后可使用注射器或移液管吸取这个富血小板层。通常，可捕获血液样 品中至少60 %、至少70 %或至少80 %的可用血小板。这些血小板可重新悬浮在可为样品体 积的约3 %至约20 %或约5 %至约10 %的体积中。
[0068] 在一些实例中，然后可使用重力血小板系统，例如CellFactorTechnologiesGPS System?离心机离心血液。装有约20cc至约150cc血液（例如，约55cc血液）和约5cc朽1 檬酸盐葡萄糖的充血注射器可缓慢地转移到可装入GPS离心机的孔内的一次性分离管中。 样品可经加盖并置于离心机内。然后可使样品旋转以从血液和血浆中分离血小板。可使样 品在约2000rpm至约5000rpm下旋转约5分钟至约30分钟。例如，可在3200rpm下进行离 心以从离心管的一侧提取，然后可通过搅拌使分离的血小板悬浮在约3cc至约5cc的血衆 中。然后可使用例如l〇cc注射器从侧孔提取PRP。如果可从患者采集约55cc的血液，则可 获得约5cc的PRP。
[0069] 因为PRP组合物包含活化血小板，所以释放出血小板内的活性剂。这些试剂包 括但不限于细胞因子（例如，IL-1B、IL-6、TNF-.α·)、趋化因子（例如，ENA-78(CXCL5)、 IL-8 (CXCL8)、MCP-3 (CCL7)、MIP-1A(CCL3)、NAP-2 (CXCL7)、PF4 (CXCL4)、RANTES(CCL5))、 炎症介质（例如，PGE2)和生长因子（例如，血管生成素-1、bFGF、EGF、FGF、HGF、IGF-I、 IGF-II、PDAF、PDEGF、PDGFAA和BB、TGF-β1、2 和 3 及VEGF)。
[0070] 如本文中所用的术语"胶原"是指具有三螺旋结构并且含有重复Gly-X-Y三联体 的多肽，其中X和Y可为任何氨基酸，但是常常为亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸。根据一个实 施方案，胶原为I、II、III、V、XI型或来自其的生物活性片段。
[0071] 本发明的胶原也指同源物（例如，正如使用国家生物技术信息中心（NCBI)的 BlastP软件，使用默认参数所测定的，与表1所列胶原序列至少50%、至少55%、至少 60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少 91%、至少93%、至少95%或更高称为100%同源的多肽）。同源物也可指其缺失、插入或 取代变体，包括氨基酸取代，及其生物活性多肽片段。
[0072] 下面表1列出了胶原NCBI序列编号的实例。
[0073]表1
[0074]
[0075] 根据一个实施方案，本发明的胶原包含其端肽的足够部分，以致其在适合条件下 能够形成原纤维。
[0076] 因此，例如，胶原可为去端肽胶原、端肽胶原或消化原胶原。
[0077] 如本文中所用，术语"去端肽胶原"是指缺乏原胶原中通常所包含的N-端和C-端 前肽，但是包括其端肽的足够部分，以致其在适合条件下能够形成原纤维的胶原分子。
[0078] 如本文中所用，术语"原胶原"是指包含N-端前肽、C-端前肽或两者的胶原分子 (例如人）。
[0079] 如本文中所用，术语"端肽胶原"是指缺乏原胶原中通常所包含的N-端和C-端前 肽，但是仍含有端肽的胶原分子。原纤维胶原的端肽为用天然N/C蛋白酶消化后N-和C-端 前肽的残余物。
[0080] 根据另一个实施方案，所述胶原为以上类型的胶原的混合物。
[0081] 所述胶原可分离自动物（例如牛或猪）或分离自人类尸体或可使用如下文进一步 描述的重组DNA技术基因工程化。根据一个特定实施方案，所述胶原无动物源性（即非人 类）胶原。
[0082] 根据一个实施方案，所述胶原为重组人胶原。
[0083] 优选地，所述重组人胶原在植物中生长。
[0084] 下面是对获得用于本文所述PRP组合物的胶原的各种方法的描述。
[0085] 从动物分离胶原的方法在本领域中已知。可使用破坏分子间键并去除免疫原性 非螺旋端肽，而不影响赋予胶原所需特征的基础、刚性三螺旋结构的各种蛋白水解酶（例 如猪粘膜胃蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原酶、无花果蛋白酶、 木瓜蛋白酶、肽酶、蛋白酶A、蛋白酶K、胰蛋白酶、微生物蛋白酶和相似酶或此类酶的组 合）实现天然动物胶原的分散和溶解（制备纯化可溶性胶原的一般方法，参见美国专利 第 3, 934, 852、3, 121，049、3, 131，130、3, 314, 861、3, 530, 037、3, 949, 073、4, 233, 360 和 4, 488, 911号）。随后可通过在低pH和高离子强度下重复沉淀，接着洗涤并且在低pH下重 新溶解而纯化所得可溶性胶原。
[0086] 表达胶原链和原胶原的植物在本领域中已知，参见例如W006035442A3 ;Merle等， FEBSLett. 2002年 3 月 27 日；515 (1-3) :114-8.PMID:11943205;和Ruggiero等，2000，FEBS Lett. 2000 年 3 月 3 日；469(1) :132-6.PMID: 10708770 ;和美国专利申请 2002/098578 和 2002/0142391以及美国专利第6, 617, 431号，其各自通过引用并入本文。
[0087] 应了解本发明还考虑到了胶原/去端肽胶原的基因修饰形式-例如胶原酶耐受性 胶原等[Wu等，ProcNatl.AcadSci，第 87 卷，第 5888-5892 页，1990]〇
[0088] 重组胶原可在任何动物或非动物细胞中表达。非动物细胞的实例包括但不限于植 物细胞和其它真核细胞例如酵母和真菌。动物细胞的实例包括但不限于CH0细胞和乳。
[0089] 可在其中生成（即表达）人胶原的植物可具有低等（例如苔藓和藻类）或高等 (维管）植物种类，包括其组织或离体细胞和提取物（例如细胞悬浮液）。优选的植物为能 够累积大量胶原链、胶原和/或下文所述的加工酶的植物。此类植物也可根据其对应力条 件的抵抗力和可以提取表达的组分或组装的胶原的简易度选择。可在其中表达人原胶原的 植物的实例包括但不限于烟草、玉米、紫花苜蓿、水稻、马铃薯、大豆、西红柿、小麦、大麦、菜 籽、胡萝卜、莴苣和棉花。
[0090] 重组原胶原的生成通常通过受编码人原胶原的外源多核苷酸序列的稳定或瞬时 转化而实现。
[0091] 植物中人端肽胶原的生成通常通过受编码人原胶原的外源多核苷酸序列和编码 有关蛋白酶的至少一个外源多核苷酸序列的稳定或瞬时转化而实现。
[0092] 胶原的三螺旋结构的稳定性需要通过酶脯氨酰基-4-羟化酶（P4H)羟基化脯氨 酸以在胶原链内形成羟脯氨酸。虽然植物能够合成含羟脯氨酸的蛋白质，但是在植物细 胞中负责合成羟脯氨酸的脯氨酰基羟化酶与哺乳动物P4Η相比表现出相对宽松的底物 序列特异性。因此，仅在Gly-X-Υ三联体的Υ位生成含羟脯氨酸的胶原需要胶原和人 或哺乳动物P4H基因的共同表达[Olsen等，AdvDrugDelivRev. 2003年11月28日； 55(12):1547-67]〇
[0093] 因此，根据一个实施方案，胶原定向于植物的无内源P4H活性的亚细胞区室。如本 文中所用，短语"无内源P4H活性的亚细胞区室"是指细胞的不包括植物P4H或具有植物样 P4H活性的酶的任何分隔区域。
[0094] 根据一个实施方案，所述亚细胞区室为空泡。
[0095] 表达的胶原在无内源性P4H活性的亚细胞区室内的累积可经由几种方法中的任 一种实现。
[0096] 例如，表达的胶原可包括用于使表达的蛋白质靶向亚细胞区室例如空泡的信号序 列。因为P4H与表达的胶原链一起共同累积是必需的，所以其编码序列优选经相应地修饰 (例如，通过信号序列的添加或缺失）。因此，P4H与胶原一起在植物中共同表达，由此P4H 也包括用于靶向相同亚细胞区室例如空泡的信号序列。优选地，胶原序列和P4H序列两者 均无内质网滞留信号，以便其通过ER并留在空泡中，序列在空泡中羟基化。
[0097] 因此本发明考虑到了共同表达人胶原和能够正确羟基化胶原α链[即仅羟基 化Gly-X-Y三联体的脯氨酸（Υ)位置]的Ρ4Η两者的基因修饰细胞。Ρ4Η是由基因库第 P07237和P13674号中提出的两个亚基α和β组成的酶。两个亚基是形成活性酶所必需 的，而β亚基还具有伴侣功能。
[0098] 本发明的基因修饰细胞所表达的Ρ4Η优选为哺乳动物Ρ4Η(例如，如SEQIDNo: 3 和4编码的人P4H)。另外，也可使用表现出更强的底物特异性的P4H突变体或P4H同源物。
[0099] 在哺乳动物细胞中，胶原还经赖氨酰羟化酶、半乳糖基转移酶和葡糖基转移酶修 饰。这些酶依次将特定位置的赖氨酰残基修饰为在特定位置的羟基赖氨酰基、半乳糖基羟 基赖氨酰基和葡糖基半乳糖基羟基赖氨酰基残基。单一人类酶，如基因库第060568号所示 的赖氨酰羟化酶3 (LH3)可催化如同在羟赖氨酸连接的碳水化合物形成中所见的全部三个 连续修饰步骤。
[0100] 因此，本发明经基因修饰的细胞也可表达哺乳动物LH3。LH3编码序列例如用SEQ IDN0:5表示的LH3编码序列可用于此类目的。
[0101] 可由包括位于功能启动子的转录控制下的编码原胶原α链和/或修饰酶（例如 Ρ4Η和LH3)的多核苷酸序列的稳定整合或瞬时表达核酸构建体表达上述胶原和修饰酶。此 类核酸构建体（本文也称为表达构建体）可配置用于在整个生物体（例如植物、规定组织 或规定细胞）和/或在生物体的规定发育阶段表达。此类构建体也可包括选择标记（例如 抗生素抗性）、增强子元件和用于细菌复制的复制起点。
[0102] 存在各种将核酸构建体引入单子叶和双子叶植物中的方法（Potrykus,I.，Annu. Rev.Plant.Physiol·,Plant.Mol.Biol. (1991) 42:205-225;Shimamoto等，Nature(1989) 338:274-276)。此类方法依赖于核酸构建体或其一部分稳定整合到植物基因 组中，或依赖于核酸构建体的瞬时表达，在这种情况下这些序列未被植物的后代遗传。
[0103] 另外，存在可将核酸构建体直接引入含DNA的细胞器例如叶绿体的DNA中的几种 方法。
[0104] 存在实现外源序列，例如本发明的核酸构建体中所包括的外源序列向植物基因组 的稳定基因组整合的两种原理方法：
[0105] 土壤杆菌介导的基因转移：Klee等（1987)Annu.Rev.Plant Physiol. 38:467-486;Klee和Rogers在CellCultureandSomaticCellGenetics ofPlants中，第 6 卷，MolecularBiologyofPlantNuclearGenes，编辑Schell,J. 和Vasil,L.K.，AcademicPublishers,SanDiego,Calif. (1989)第 2-25 页； Gatenby，在PlantBiotechnology中，编辑Kung，S.和Arntzen，C.J.，Butterworth Publishers,Boston,Mass. (1989)第 93-112 页。
[0106] (ii)DNA直接摄取：Paszkowski等，在CellCultureandSomaticCell GeneticsofPlants中，第 6 卷，MolecularBiologyofPlantNuclearGenes，编辑 Schell，J.和Vasil，L.K·，AcademicPublishers,SanDiego,Calif. (1989)第 52-68 页；包括向原生质体直接摄取DNA的方法，Toriyama,K.等（1988)Bio/Technology 6:1072-1074。通过植物细胞短暂电击诱导的DNA摄取：Zhang等PlantCellR印. (1988)7:379-384。Fromm等Nature(1986) 319:791-793。通过粒子轰击将DNA注 入植物细胞或组织中，Klein等Bio/Technolo