使用工程改造的内含肽生产肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生产肽的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达，其中 所述融合蛋白包含靶肽和工程改造的内含肽。
[0002] 发明背景 肽是一类快速发展的治疗剂，目前市场上有超过50种基于肽的产品，在涵盖诸如免疫 学、肿瘤学、神经病学和内分泌学等疾病领域的开发中甚至更多。肽主要通过与特定细胞受 体的相互作用调节许多生理机能，籍此它们诱导细胞信号转导事件，例如神经传递和激素 的释放。由于其有限的体内稳定性和生物利用度所致，内源性肽作为治疗剂具有挑战。然 而，高特异性和低毒性结合选择性修饰和改进肽的治疗性质的改进能力提高肽在药物研发 中的关联性。
[0003] 在内分泌学中，疾病常常由肽激素水平失衡引起或与之有关，正如诸如糖尿病和 肥胖症等疾病中所见。值得注意的是，内分泌和神经系统中大约一半的肽激素在其C端是 酰胺化的，而α_酰胺部分对于生物活性和稳定性常常是决定性的。某些治疗性肽， 包括涉及肥胖症和糖尿病的肽激素（例如肽ΥΥ(ΡΥΥ)、胰肽（ΡΡ)、α-降钙素基因相关肽 (α-CGRP)、降钙素（CT)和胰岛淀粉样多肽），需要在C端中的α-酰胺部分以获得完整的 生物活性。
[0004]用于产生肽治疗剂的最广泛采用的技术是微生物表达系统和化学合成。虽然肽C 端酰胺容易通过化学合成获得，但是不容易引入来源于缺乏α-酰胺化酶机制的微生物宿 主的重组肽中。因此，酰胺必须作为翻译后修饰引入。
[0005]内含肽是在单细胞生物中表达的在氨基端和羧基端两端具有侧翼蛋白质序列的 自身催化性蛋白质结构域。氨基端和羧基端序列被命名为外显肽，这与外显子和内含子的 DNA命名法一致。内含肽新兴家族的一个看似典型的成员是蟾分支杆菌（ifycoAacteri? χ??Λ〇/^)的GyrA基因产物（ifreGyrA)。其分子量为约22kDa，在氨基端（半胱氨酸）和在 羧基端（组氨酸和天冬酰胺）含有多个决定性的氨基酸。另外，羧基端外显肽必须始于半 胱氨酸、丝氨酸或苏氨酸。在完成翻译后的某个点上，氨基端外显肽和内含肽间的肽键通过 涉及内含肽氨基端半胱氨酸的N至S酰基转移而转化成硫酯键。该键然后在羧基端外显肽 的开端与亲核残基（丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸）交换，然后随着天冬酰胺在内含肽C端的 参与，内含肽将自身切割出来，同时第二酰基转移在氨基端和羧基端外显肽之间产生天然 肽键。这些协同反应的整体作用是两个外显肽无缝连接，且释放出内含肽。
[0006] 设计了突变型内含肽，其中通过突变使自我剪接功能失效，以在氨基端或羧基端 剪接点任一个上允许切割。对于ifreGyrA内含肽，通过N198A突变使得氨基端切割成为 可能。氨基端外显肽被另一多肽序列即靶肽置换，使得在所得融合蛋白用亲核化学剂（例 如2-巯基乙磺酸钠（MESNa))切割后能够制备具有反应性羧基端α-硫酯柄（handle)的 靶肽。所述内含肽来源的α-硫酯可与任何亲核体反应，并可用作用于化学连接、生物缀 合或酰胺化的化学柄（chemicalhandle)。基于内含肽的方法已被用来重组生产实验室 规模的α-酰胺化的肽（TO98/50563A1;TO00/00625A1NottinghamI.R.等，Nat. Biotechnol. 2001， 19， 974-977)。
[0007] 应用该技术大规模生产C端α-酰胺化肽的主要限制是通常观察到的低产量，这 可归因于大的内含肽大小和内含肽融合蛋白水解不稳定性的组合。在ifreGyrA内含肽中 引入T3C突变已表明与成熟前裂解降低有关（CuiC.等， 5? 7^-67)。此外，内含肽的大小比肽激素的大小大，且内含肽大小的降低通过更经济地利 用宿主蛋白质合成机制，可潜在地改进肽激素的最终产量。
[0008] 发明概述 本发明提供通过重组手段生产肽的方法。肽作为包含靶肽和工程改造的内含肽的融合 蛋白的一部分表达，且在硫醇基诱导切割融合蛋白时，获得靶肽的羧基端α-硫酯。羧基端 α-硫酯原则上可与任何亲核体反应，因此该策略允许更大范围的羧基端修饰，例如化学连 接、生物缀合或酰胺化。基于内含肽的策略的另一个优势是肽α-硫酯通过肽-内含肽融 合蛋白的硫解作用产生，潜在地避免了对加工酶的需要。
[0009] -方面，本发明提供用于生产肽的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部 分表达的步骤，其中所述融合蛋白包含靶肽和内含肽，其中所述内含肽的大小被减到最小， 并且通过与ifreGyrA内含肽（SEQIDΝ0:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
[0010] 另一方面，本发明提供包含靶肽和内含肽的融合蛋白，其中所述内含肽的大小被 减到最小，并且通过与ifreGyrA内含肽（SEQIDΝ0:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱 氨酸突变。
[0011] 另一方面，本发明提供内含肽，其大小被减到最小，并且通过与ifreGyrA内含肽 (SEQIDNO: 1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
[0012] 另一方面，本发明提供编码包含至少靶肽和内含肽的融合蛋白的DNA构建体，其 中所述内含肽的大小被减到最小，并且通过与ifreGyrA内含肽（SEQIDN0:1)的3位对齐 在相应位置上携带半胱氨酸突变。
[0013] 由于靶肽的低产量所致，采用基于内含肽的方法的肽α-硫酯的重组生产限于实 验室规模，该方法涉及将靶肽作为内含肽的氨基端融合物的表达。
[0014] 本发明的工程改造的内含肽在大小上被减到最小，并且通过与ifreGyrA内含肽 (SEQIDNO: 1)的3位对齐在相应位置上具有半胱氨酸突变，导致融合蛋白的表达水平提高 和分离靶肽的产量较高，因此使本发明的方法适于生产规模。
[0015] 附图简述 图1:编码在含有蛋白酶位点（SEQIDN0: 8)的氨基端标签（SEQIDN0: 4)和羧基 端GyrA内含肽变体（SEQIDNO: 17)之间融合的[Gly4]-APYY4-36(SEQIDNO:10)的质 粒1A的代表性pETlla载体图。整个融合蛋白用特征蛋白质1A标记。描绘了NdeI、NheI、 NsiI、XhoI和BamHI限制性内切酶位点。载体图中还显示了T7启动子区、氨苄西林抗性基 因、lacI阻抑物区和复制起点。
[0016] 图2:制备羧基端修饰的靶肽的基本原理的代表性示意图。使靶肽与可通过亲核 切割释放的羧基端内含肽融合，产生作为α-硫酯、α-酰胺或具有合成羧基端片段的靶 肽。如本文所示，靶肽进一步与氨基端亲和标签融合，所述标签可以通过通过酶促切割除 去。该纯化标签还可置于内含肽的羧基端，避免对加工酶的需要。
[0017]发明描述 肽作为治疗剂在包括代谢疾病（例如糖尿病和肥胖症）在内的广泛范围的疾病中越来 越有益。包括涉及肥胖症和糖尿病的肽激素（例如PYY、PP、a-CGRP、CT和胰岛淀粉样多 肽）的某些治疗性肽在羧基端需要α-酰胺部分以获得完整的生物活性。一个挑战是通过 重组手段且特别是呈生产规模地生产所述肽。
[0018] 本发明提供工程改造的内含肽，其在大小上被减到最小并在通过与ifreGyrA内含 肽（SEQIDNO: 1)的3位对齐在相应的位置上携带半胱氨酸点突变。内含肽可用于肽的重 组生产，其中肽作为包含靶肽和本发明的工程改造的内含肽的融合蛋白的一部分表达（参 见图2)。通过与ifreGyrA内含肽（SEQIDN0:1)的3位对齐在相应的位置上的半胱氨酸突 变与内含肽最小化的组合增加内含肽融合蛋白的表达产量及由此增加靶肽的产量。后者通 过如下获得：融合蛋白的硫醇基诱导的切割产生靶肽的α-硫酯，其可通过加入铵亲核体 (例如碳酸氢铵（ammoniabicarbonate))被转化为祀肽相应的α-酰胺。本发明的工程改 造的内含肽因此提供产生α-酰胺化的肽激素（例如ΡΥΥ、ΡΡ、胰岛淀粉样多肽和a-CGRP) 的优化策略。由于较高的表达产量和分离靶肽的较高产量，本发明因此提供以生产规模重 组生产α-酰胺化的肽的方法。
[0019] 通过该方法产生的α-硫酯还可用于化学连接或生物缀合，且一方面，本发明提 供用于重组生产羧基端生物缀合的蛋白质和肽的方法。
[0020] -方面，本发明涉及用于生产肽的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部 分表达的步骤，其中所述融合蛋白包含靶肽和内含肽，其中所述内含肽的大小被减到最小， 并且通过与ifreGyrA内含肽（SEQIDΝ0:1)的3位对齐在相应位置上具有半胱氨酸突变。 [0021 ] -方面，本发明提供包含靶肽和内含肽的融合蛋白，其中所述内含肽的大小被减 到最小，并且通过与ifreGyrA内含肽（SEQIDΝ0:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨 酸突变。一方面，本发明提供内含肽，其大小被减到最小，并且通过与ifreGyrA内含肽（SEQ IDNO: 1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。一方面，本发明提供编码包含靶 肽和内含肽的融合蛋白的DNA构建体，其中所述内含肽的大小被减到最小，并且通过与ifre GyrA内含肽（SEQIDNO: 1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
[0022] 内含妝是在单细胞生物表达的在氣基端和駿基端两端具有侧翼蛋白质序列的 自身催化性蛋白质结构域。一方面，内含肽是GyrA内含肽。GyrA内含肽是一类被插入 编码一些细菌的DNA促旋酶A亚基的基因序列内的内含肽，所述细菌通常为分支杆菌属 (ifycoAacterii/a?)菌株。这类内含肽由共享高序列同源性且特征为在氨基端具有Cys和在 羧基端具有His-Asn的16种不同的内含肽组成。而且，所有这些内含肽通过在氨基端-外 显肽的羧基端中具有Tyr和羧基端-外显肽的氨基端中具有Thr来识别。一般而言，这些内 含肽的大小约420个氨基酸且氨基端和羧基端剪接区被D0D归巢内切核酸酶结构域中断。 然而，GyrA内含肽缺乏D0D回归内切核酸酶结构域，并且与其它GyrA内含肽相比，在 氨基和羧基剪接结构域之间具有较少量的残基，这导致整体大小为198个氨基酸。该内含 肽的X射线晶体结构显示，与氨基酸残基107-164对应的这个区由两个α-螺旋以及非结 构化区域组成，所述非结构化区域从内含肽特有的HINT剪接结构域中突出出来并且不是 HINT剪接结构域的一部分。
[0023] -方面，内含肽是ifreGyrA内含肽，其广泛用于实验室规模以生产蛋白质α-硫 酯用于化学连接目的。该内含肽具有几个有利的性质（例如从细菌包含体中重折叠的能 力），在变性剂存在下保持活性和对氨基端-外显肽的羧基端残基的低序列要求。在SEQID NO: 1中显示了ifreGyrA内含肽的氨基酸序列。
[0024] -方面，内含肽是通过切除残基107-164的一部分或用序列GSGSGSGS的接头置换 切除的残基使大小减至最小的ifreGyrA内含肽。
[0025] -方面，内含肽是通过切除残基107-160且用序列GSGSGSGS的接头置换切除的残 基被使大小减至最小的ifreGyrA内含肽。
[0026] -方面，内含肽是具有SEQIDN0: 20的序列的携带T3C突变的最小化的ifre GyrA内含肽。
[0027] -方面，靶肽是在其羧基端被α-酰胺化的肽激素。全部哺乳动物肽激素的大约 50%在其羧基端被α_酰胺化，这种α_酰胺官能团对生物活性常常是决定性的。几个肽 激素现今在代谢疾病例如糖尿病和/或肥胖症的治疗中用作药物。实例为胰岛淀粉样多 肽（例如Symlin?，醋酸普兰林肽，一种人胰岛淀粉样多肽的类似物）。人胰岛淀粉样多肽 是一种37个残基α-酰胺化的肽激素，其可用于治疗或预防糖尿病和/或肥胖症。因此， 胰岛淀粉样多肽的羧基端需要被α-酰胺化以获得完整的生物活性。同样，PYY、PP、CT和 α-CGRP应α-酰胺化以获得完整的生物活性。羧基端α-酰胺部分还可用来保护不受蛋 白水解性降解。羧基端α-酰胺化和非酰胺化胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)的比较表明酰 胺化不影响所观察到的对胰岛素和胰高血糖素分泌的总体生物作用。然而，对于非酰胺化 变体，广泛的羧基端降解发生在血浆中。因此，对于一些肽和蛋白质，作为延长全长和生物 活性蛋白质在血浆中的存在的手段引入羧基端酰胺化可能是有益的。本发明因此提供用于 获得这样的肽或蛋白质的备选方法，所述肽或蛋白质是针对生物活性被羧基端α-酰胺化 的或防止血浆中的羧肽酶降解的。
[0028] 靶肽作为羧基端α-硫酯从融合蛋白中释放，这可通过亲核酰基取代反应与许多 亲核体反应，本发明因此还提供用于生产范围更广的包含羧基端修饰的肽方法，所述羧基 端修饰例如通过化学连接、与生物学或非生物学部分生物缀合的肽延长和酰胺化。
[0029] 肽ΥΥ(ΡΥΥ)和胰肽（ΡΡ)两者属于一类ΡΡ折叠家族的肽，神经肽Υ(ΝΡΥ)也属于 该家族。它们全作为具有羧基端酰胺的36个氨基酸肽天然分泌。它们的特征在于共同的 三维折叠，即ΡΡ折叠，其被视为对其生物功能是重要的稳定元件。SEQIDΝ0: 2和SEQID NO: 14分别显示了人ΡΥΥ(1-36)和人ΡΡ(1-36)的氨基酸序列。根据这些肽的某些在动物 模型和人中显示厌食作用，PP折叠肽或其类似物被提议用于治疗肥胖症和相关疾病。
[0030] 所谓PYY意指人肽激素及其物种变体。一方面，靶肽是PYY或其类似物。PYY在餐 时从远端小肠和结肠的L细胞中释放。PYY作为PYY(1-36)释放，但被二肽基肽酶IV(DPP IV)切割成PYY(3-36)，其构成循环PYY的约50%。已知PYY(3-36)在GI道中具有外周作用， 还在中枢起饱满感信号的作用。术语"人PYY"和"APYY"欲指SEQIDN0: 2的ΑΡΥΥ(1-36) 或备选SEQIDNO: 11的APYY(3-36)，其在1和2位具有氨基端氨基酸缺失。一方面，术 语PYY意指人PYY。一方面，靶肽是PYY(3-36)。一方面，靶肽是APYY(3-36)。一方面，靶 肽是PYY的类似物