BLyS拮抗肽SS12、含该拮抗肽的融合蛋白SS12-Fc及基因的制作方法
【专利摘要】本发明公开了BLyS拮抗肽SS12、含该拮抗肽的融合蛋白SS12-Fc及基因，实验证明SS12-Fc和3SS12-Fc融合蛋白可以和BLyS结合，并且抑制BLyS与BCMA、BLyS与TACI的相互作用。SS12-Fc和3SS12-Fc融合蛋白既保障了SS12和3SS12空间结构的稳定性，又不削弱肽的活性。同时SS12和3SS12得到Fc标签，更易于纯化与检测。因此，SS12-Fc和3SS12-Fc可以作为治疗BLyS拮抗剂应用于自身免疫疾病和淋巴瘤的潜在药物。
【专利说明】BLyS拮抗肽SS1 2、含该拮抗肽的融合蛋白SS1 2-Fc及基因
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，特别是涉及BLyS拮抗肽，以及含BLyS拮抗肽的融合蛋 白及基因及质粒。
【背景技术】
[0002] B淋巴细胞刺激因子（B lymphocyte stimulator, BLyS)，又称为B细胞激活因子 (B cell activating factor belonging to the TNF family, BAFF)，是 TNF 家族中的一 员。由单核细胞和巨噬细胞持续合成、分泌。BLyS能够结合B细胞表面的三种受体，B细 胞成熟抗原（B cell mature antigen, BCMA)，跨膜激活物和 CAML 结合物（Transmembrane activator and CAML-interactor, TACI)以及 BLyS 受体 3 (BR3)。受体结合 BLyS 后，偶联 TNF 受体相关因子（TNF receptor associated factor, TRAF)，激活 NF-KB 途径。最终，诱 导抗细胞凋亡基因：Bcl-2、Bcl-xL的表达，减少成熟B细胞的凋亡。如果敲除BLyS，小鼠体 内的成熟B细胞完全缺失。因此，BLyS在B细胞的发育和成熟过程中起至关重要的作用。
[0003] 由于BLyS在B淋巴细胞活化、增殖中发挥重要作用，而B淋巴细胞产生的抗体 所介导的体液免疫在众多已发现的自身免疫性疾病当中处于中心地位。因此，目前认为 BLyS在体内的过量表达与某些自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE)、类风湿性关节炎 (RA)、口眼干燥综合征（Siogren)等病程的发生、发展密切相关。过量表达BLyS的转基因 小鼠出现系统性红斑狼疮样症状。临床实验也发现，SLE和Siogren综合征病人的血清中， 可溶性BLyS明显高于正常人。同时，作为B细胞刺激、存活因子，BLyS及其受体参与骨髓 瘤和淋巴瘤的发生和发展。因此，以阻断BLyS生物学功能为策略，探讨BLyS拮抗剂治疗系 统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病和B细胞肿瘤疾病的研究正在国外如 火如荼的进行中。目前，针对BLyS的抑制剂的研究主要集中在研制具有中和BLyS作用的 BLyS诱馆受体（decoy receptor)、抗BLyS抗体和拮抗肽（1，2)。2011年3月美国FDA批 准由人类基因科学公司（Human Genome Sciences)和葛兰士-史克（GlaxoSmithKline)公 司联合研发的抗BLyS抗体BENLYSTA (Belimumab)治疗系统性红斑狼疮。这是50年来，FDA 首次批准治疗该类疾病的药物。因此，BLyS拮抗剂有着广泛的临床应用前景。
[0004] 众多研究已经详细阐述BLyS与受体相互作用的可能模式及关键氨基酸。所以，针 对BLyS与其受体结合核心区域的拮抗肽也成为BLyS抑制剂的策略。与抗体和诱饵蛋白等 大分子拮抗剂相比，多肽具有分子量小、渗透性强、人工合成简单、免疫原性低，毒性低和副 作用少的优点。然而，多肽也存在不稳定、效率低和半衰期短的缺点。我们在前期工作中探 讨了 BLyS拮抗肽抑制BLyS的功能，初步结果显示：合成的16个氨基酸的肽在体外能够部 分抑制BLyS的作用（3)。进一步通过计算机分子模建、优化设计BLyS拮抗肽，将有望提高其 抑制BLyS生物学功能。为开发治疗SLE和RA这类自身免疫性疾病和B细胞肿瘤的新药奠 定实验研究基础。
[0005] 1. Sun J (孙剑），Lin Z，Feng J，Li Y and Shen B (2008) BAFF-targeting therapy,a promising strategy for treating autoimmune diseases. Eur J Pharmacol597:1 - 5.
[0006] 2. Sun J (孙剑），Lin Z，Feng J，Li Y and Shen B (2008) B lymphocyte stimulator,a new target for treating B cell malignancies. Chinese Medical J121 (14):1319-1323.
[0007] 3. Sun J (孙剑），Feng J，Li Y and Shen B (2006) A novel BLyS antagonist peptide designed based on the3_D complex structure of BCMA and BLyS. Biochem Biophys Res Commun346(4):1158-1162.
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种BLyS拮抗肽SS12。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种BLyS拮抗肽3SS12。
[0010] 本发明的第三个目的是提供一种含BLyS拮抗肽SS12的融合蛋白SS12-FC。
[0011] 本发明的第四个目的是提供一种含BLyS拮抗肽3SS12的融合蛋白3SS12-FC。
[0012] 本发明的第五个目的是提供一种编码BLyS拮抗肽SS12的基因。
[0013] 本发明的第六个目的是提供一种编码融合蛋白SS12-FC的基因。
[0014] 本发明的第七个目的是提供一种含编码融合蛋白SS12-FC基因的质粒。
[0015] 本发明的第八个目的是提供一种编码BLyS拮抗肽3SS12的基因。
[0016] 本发明的第九个目的是提供一种编码融合蛋白3SS12-FC的基因。
[0017] 本发明的第十个目的是提供一种含编码融合蛋白3SS12-FC基因的质粒。
[0018] 本发明的技术方案概述如下：
[0019] BLyS 拮抗肽 SS12,是用 SEQ ID NO. 1 所示。
[0020] BLyS 拮抗肽 3SS12,是用 SEQ ID Ν0· 2 所示。
[0021] 含BLyS拮抗肽SS12的融合蛋白SS12-Fc，是用SEQ ID Ν0· 3所示。
[0022] 含BLyS拮抗肽3SS12的融合蛋白3SS12-Fc，是用SEQ ID Ν0· 4所示。
[0023] 编码BLyS拮抗肽SS12的基因，是用下述方法构建：以SEQ ID NO. 5所示序列为上 游引物，以SEQ ID NO. 6所示序列为下游引物，上、下游引物互补，通过变性、退火，配对形成 编码BLyS拮抗肽SS12的基因，所述编码BLyS拮抗肽SS12的基因如SEQ ID N0. 7所示。
[0024] 编码融合蛋白SS12-FC的基因，是用下述方法构建，用限制性内切酶EcoRI和Hind III酶切人IgGIFc DNA片段，回收630bp的Fc DNA片段，与权利要求5获得的编码BLyS拮 抗肽SS12的基因连接，得到编码融合蛋白SS12-FC的基因，所述编码融合蛋白SS12-FC的 基因如SEQ ID N0. 8所示。
[0025] 含编码融合蛋白SS12-FC基因的质粒，是用下述方法构建，用限制性内切酶Ndel 和Hind III酶切载体pET30a，回收酶切后pET30a片段，与权利要求6获得的编码融合蛋 白SS12-FC的基因加入T4连接酶，进行连接反应制成含编码融合蛋白SS12-FC基因的质粒 SS12-Fc-pET30a。
[0026] 编码BLyS拮抗肽3SS12的基因，是用下述方法构建：含有编码BLyS拮抗肽3SS12 的基因的质粒3SS12-pUC19 (由鼎国生物技术公司合成），用Ndel和EcoRI酶切获得编码 BLyS拮抗肽3SS12的基因，所述编码BLyS拮抗肽3SS12的基因如SEQ ID N0. 9所示。
[0027] 编码融合蛋白3SS12-FC的基因，是用下述方法构建，用限制性内切酶EcoRI和 Hind III酶切人IgGlFcDNA片段，回收630bp的Fc DNA片段，与权利要求8获得的编码 BLyS拮抗肽3SS12的基因连接，得到编码融合蛋白3SS12-FC的基因，所述编码融合蛋白 3SS12-FC 的基因如 SEQ ID NO. 10 所示。
[0028] 含编码融合蛋白3SS12-FC基因的质粒，是用下述方法构建，用限制性内切酶Ndel 和Hind III酶切pET30a，回收酶切后pET30a片段，与权利要求9获得的编码融合蛋白 3SS12-FC的基因加入T4连接酶，进行连接反应制成含编码融合蛋白3SS12-FC基因的质粒 3SS12-Fc-pET30a
[0029] 实验证明SS12-Fc和3SS12-Fc融合蛋白可以和BLyS结合，并且抑制BLyS与BCMA、 BLyS与TACI的相互作用。SS12-FC和3SS12-FC融合蛋白既保障了 SS12和3SS12空间结 构的稳定性，又不削弱肽的活性。同时SS12和3SS12得到Fc标签，更易于纯化与检测。因 此，SS12-FC和3SS12-FC可以作为治疗BLyS拮抗剂应用于自身免疫疾病和淋巴瘤的潜在 药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 图 1 为 SS12-Fc_pET30a 和 3SS12-Fc_pET30a 质粒示意图。
[0031] 图 2 为 SS12 双链 DNA 梯度电泳，其中，1-4 :0· lpmol/L，0. 2pmol/L，0. 4pmol/L， 0·8pmol/L;M :marker〇
[0032] 图3为Ndel和EcoRI双酶切3SS12载体质粒3SS12-pUC19,其中，1和2是3SS12 载体质粒；M :marker。
[0033] 图4为人IgGIFc片段和原核表达载体pET30a，其中1是人IgGIFc片段；2是 pET30a ;M 是 marker。
[0034] 图5为SS12-Fc菌落PCR筛选，其中，M，Marker ;2, 3,4, 5阳性菌落。
[0035] 图6为3SS12-FC菌落PCR筛选，其中，M，Marker ;1，5,6阳性菌落。
[0036] 图7为重组质粒的双酶切鉴定.其中，M，marker ;1，EcoRI和Hind III酶切 SS12-Fc-pET30a 质粒；2, EcoRI 和 Hind III 酶切 3SS12-Fc-pET30a 质粒。
[0037] 图8为SS12-FC融合蛋白和3SS12-FC融合蛋白SDS-PAGE电泳图。其中，33SS12， 3SS12-FC 融合蛋白；SS12, SS12-FC 融合蛋白；M，marker。
[0038] 图9为融合蛋白SS12-Fc和3SS12-Fc与BLyS结合的ELISA试验。
[0039] 图10为融合蛋白SS12-FC和3SS12-FC显著抑制BLyS与TACI相互作用的ELISA 试验。
[0040] 图11为融合蛋白SS12-FC和3SS12-FC显著抑制BLyS与BCMA相互作用的ELISA 试验。
【具体实施方式】
[0041] 下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发 明作任何限制。
[0042] 将BLyS拮抗肽命名为SS12和3SS12仅是为了方便描述，但并不对此进行限定。
[0043] 人BLyS蛋白：孙剑，黎燕，冯建男，孙瑛勋，胡美茹，沈倍奋.人可溶性B淋巴 细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[J].细胞与分子免疫学杂志，2006,（2)
[0044] 人TACI-Fc蛋白：冀丽军，白乌仁图雅，柴琳，孙剑.TACI-Fc融合蛋白的基因构 建、原核表达及生物活性鉴定[J].生物技术，2013,（3).
[0045] 人TACI-Fc-myc蛋白：白乌仁图雅，赵亚璁，朱燕锋，孙剑.sTACI-Fc-Myc融合蛋 白基因的构建，原核表达及活性鉴定[J].现代生物医药进展，2014,（印刷中）.或白乌仁 图雅.新颖BAFF拮抗肽体抑制BAFF与其受体TACI相互作用的功能研究.[D].天津大 学，2014
[0046] 人BCMA-Fc蛋白：孙剑，冯建男，林周，黎燕，沈倍奋.计算机辅助设计可溶性 BLyS受体，eBCMA-Fc融合蛋白及其在大肠杆菌中的表达.中国生物化学与分子生物学报 2008, 24(2) : 127 - 133.
[0047] 人BCMA-Fc-myc蛋白：朱燕锋，柴林，臧梦存.BCMA-Fc-Myc融合蛋白的构建、表达 及活性鉴定[J].生物技术，2013, 23 (5) : 24-28.
[0048] 人Fc蛋白：吴真.BCMA-Fc作为潜在药物的研究[D].天津大学，2012
[0049] 包被液：称量出33. 6g碳酸氢钠和63. 6g无水碳酸钠，将其放如烧杯中，向内加入 600ml蒸馏水，搅拌至溶质全部溶解，再加入蒸馏水中定容到1 了 L。将其放在4°C下保存。
[0050] PBST的配制：在取250 μ 1吐温-20加入500ml的1 XPBS中，混合均匀至完全融 合。在室温下保存
[0051] 5%脱脂奶粉的配制：称取脱脂奶粉lg，搅拌下溶解于10ml0.01M PBS中，加 PBS定 容至20ml，于4°C保存
[0052] TMB显色液：取4. 95ml底物缓冲液，0. 05ml 1 % TMB储液，临用前加入5 μ 130 %过 氧化氢。
[0053] 1% ΤΜΒ储液：称取lg ΤΜΒ，搅拌下充分溶解于80ml DMS0中，加 DMS0定容至 100ml，保存于 4°C。
[0054] 底物缓冲液（pH5. 0):取24. 3ml0. 1M柠檬酸，25. 7ml0. 2M磷酸氢二钠，加入约 40ml水，调pH至5. 0,再加水定容至100ml，保存于室温。TMB工作液（现配现用）
[0055] 本发明基于BLyS和其受体的晶体结构，通过计算机模建，模拟BLyS与受体的相互 作用模式和条件优化，辅助设计理论上拮抗BLyS与受体相互作用的拮抗肽。为了保障拮抗 肽的空间结构和稳定性，通过基因工程的方法，将有抑制活性的拮抗肽基因与人IgGiFc序 列连接，最终得到性质稳定的BLyS拮抗肽-Fc融合蛋白，进一步通过生物实验验证BLyS拮 抗肽-Fc融合蛋白的功能活性。为开发有临床应用前景的新药先导药物奠定了实验研究基 础。
[0056] 实施例1
[0057] BLyS与其受体相互作用的结构信息和新型靶向BLyS拮抗肽的设计
[0058] 利用计算机辅助分子对接及动力学模拟探讨了 BLyS与其受体相互作用模式，借 助计算机图形学、距离几何学分析了 BLyS与其受体相互识别的关键氨基酸残基。
[0059] 通过计算机辅助分子设计以及高通量虚拟筛选技术从头设计能够模拟受体关键 氨基酸构象的短肽，进而借助从头搭建、分子对接、动力学模拟从理论上评价BLyS与拮抗 肽的作用；利用计算机图形学技术、距离几何学以及分子间氢键作用评价拮抗肽潜在的生 物学效应。经过理论筛选得到BLyS拮抗肽，命名为SS12,是用SEQ ID NO. 1所示。
[0060] 实施例2
[0061] 分别构建含SS12-Fc和3SS12-Fc融合蛋白基因的质粒SS12-Fc-pET30a和 3SS12-Fc-pET30a (图 1)。
[0062] 2. 1编码BLyS拮抗肽SS12的基因，是用下述方法构建：依据拮抗肽SS12的氨基 酸序列，我们设计了两条编码短肽的DNA引物，并通过公司订购合成。
[0063] SS12上游引物是以SEQ ID N0. 5所示，SS12下游引物是以SEQ ID N0. 6所示
[0064] 合成的SS12的DNA引物加入200 μ 110mM Tris-Hcl (ρΗ8· 5)溶解（终浓度为 16pmol/μ 1)。各取SS12基因的正链和负链20 μ 1，混合在ΕΡ管中，100°C水浴煮沸3min， 逐渐冷却至室温。用2%的琼脂糖凝胶电泳，观察退火结果。电泳结果显示65bp处有明显 条带（图2)，证明配对形成编码BLyS拮抗肽SS12的基因合成成功如SEQ ID N0. 7所示。
[0065] 2. 2依据BLyS拮抗肽SS12氨基酸序列，我们设计了 3拷贝SS12 (BLyS拮抗肽 3SS12)。其氨基酸序列为：GSSNPTFGSTSKGGGGSGSSNPTFGSTSKGGGGSGSSNPTFGSTSKGGGGS(SE Q ID NO. 2)。其中，斜体为SS12序列，下划线标注为连接肽。3SS1基因序列通过公司订购 合成。编码BLyS拮抗肽3SS12的基因序列是SEQ ID N0. 9所示。
[0066] 合成的3SS12的基因序列插入在pUC19质粒载体上（得到含有编码BLyS拮抗肽 3SS12的基因的质粒3SS12-pUC19)，5'端含有Ndel酶切位点，3'端含有EcoRI酶切位点； 通过限制性内切酶Ndel和EcoRI酶切得到162bp的编码BLyS拮抗肽3SS12的基因（见图 3)。
[0067] 人IgGIFc片段由PCR技术获得（见图4)，Fc片段（已知序列）经过限制性内切 酶EcoRI和Hind III酶切之后，分别与SS12基因和3SS12基因连接在被Ndel和Hind III 酶切过的载体pET30a上，得到连接体系，同时制备空质粒阴性对照组。
[0068] 将连接体系转化进入JM109大肠杆菌中。SS12组菌落PCR结果显示2号、3号、4 号、5号菌种为阳性（见图5) ;3SS12组菌落PCR结果显示1号、5号、6号菌种为阳性（见 图6)。对SS12组的1号、2号菌种提取质粒酶切，结果750b处有目的条带（见图7)。对 3SS12组的1号、2号菌种提取质粒酶切，结果750b处有目的条带（见图7)。菌落PCR和 双酶切结果表明了构建的含编码融合蛋白SS12-FC基因的质粒SS12-Fc-pET30a和含编码 融合蛋白3SS12-FC基因的质粒3SS12-Fc-pET30a的正确性。将SS12组2号、3号4号、 5号菌种送生物公司测序，测序结果进行序列比对，SS12-FC基因序列正确率100%，表明 SS12-Fc-pET30a重组质粒构建成功。将3SS12组1号、5号、6号菌种送生物公司测序，测序 结果进行序列比对，3SS12-FC基因序列正确率100%，表明3SS12-Fc-pET30a重组质粒构建 成功。
[0069] 编码融合蛋白SS12-FC基因序列是：
[0070] GGTTCTTCTAACCCGACCTTCGGTTCTACCTCTAAAGGTGGAGGTGGATCTCCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAG TGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT TCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTG CTGGACTCCGACGGCCCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTT CTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO. 8)。其中斜体字部分SS12基因，下划线标注的部分是连接肽DNA序列，其余部分是 Fc基因。该序列中1-51人工序列；52-681生物来源，动物界脊索动物们脊椎动物亚门哺乳 纲真兽亚纲灵长目类人猿亚目人科Homo sapiens IgGIFc。
[0071] 表达SS12-Fc。含BLyS拮抗肽SS12的融合蛋白SS12-Fc序列为：
[0072] GSSNPTFGSTSKGGGGSPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK。（SEQ ID N0.3);其中斜体部分是SS12氨基酸序列，下划线标注的是连接肽，余下的部 分是Fc氨基酸序列。该序列中1-17人工序列；18-226生物来源，动物界脊索动物们脊椎 动物亚门哺乳纲真兽亚纲灵长目类人猿亚目人科Homo sapiens IgGIFc。
[0073] 编码融合蛋白3SS12-FC的基因序列是：
[0074] GGTTCTTCTAACCCGACCTTCGGTTCTACCTCTAAAGGTGGAGGTGGAGGTTCCGGTTCTTCTAACCCG ACCTTCGGTTCTACCTCTAAAGGTGGAGGTGGAGGTTCCGGTTCTTCTAACCCGACCTTCGGTTCTACCTCTAAAGG TGGAGGTGGAGGTTCCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCT GCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAG AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCCCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCG TGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACG CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTMAJSEQ ID N0. 10);其中斜体字部分 SS12 基因，下划线标 注的是连接肽DNA序列，其余部分是Fc基因，表达3SS12-FC融合蛋白。该序列中1-162人 工序列；163-792生物来源，动物界脊索动物们脊椎动物亚门哺乳纲真兽亚纲灵长目类人 猿亚目人科 Homo sapiens IgGIFc。
[0075] 含BLyS拮抗肽3SS12的融合蛋白3SS12-FC序列为：
[0076] GSSNPTFGSTSKGGGGSGSSNPTFGSTSKGGGGSGSSNPTFGSTSKGGGGSPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。（SEQ ID N0.4)其中斜体部分是 3SS12 氨基 酸序列，下划线标注的是连接肽，余下的部分是Fc氨基酸序列。该序列中1-48人工序列； 49-258生物来源，动物界脊索动物们脊椎动物亚门哺乳纲真兽亚纲灵长目类人猿亚目人科 Homo sapiens IgGlFc。
[0077] 实施例3
[0078] SS12-FC和3SS12-FC融合蛋白的诱导和表达
[0079] 将测序正确的重组质粒SS12-Fc-pET30a和3SS12-Fc-pET30a分别转化到表达宿 主菌大肠杆菌E. Coli. BL21进行高表达菌株筛选，发现在IPTG浓度0. 5mM，16°C慢速振摇 的条件下诱导，能够诱导出目的蛋白。选取高表达菌株进行大量表达，经蛋白A凝胶亲和层 析柱纯化，收集洗脱液，在1XPBS中透析，用紫外分光光度计测量计算SS12-FC蛋白浓度为 700ng/y l，3SS12-Fc蛋白浓度为HOOng/μ 1。取透析后的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳， 发现，SS12-FC 和 3SS12-FC 蛋白的大小分别为 25. 4kDa 和 28. 6kDa，和 SS12-FC 和 3SS12-FC 大小一致，并且具有较高纯度（见图8)。
[0080] 实施例4
[0081] ELISA实验验证SS12-FC和3SS12-FC融合蛋白的结合活性
[0082] 用包被液稀释BLyS蛋白至终浓度为10yg/ml，取50yL于酶标板中，4°C，18h。用 ?851'洗涤酶标板3次，每次511^11。每孔加15(^15%脱脂奶粉，371：，温育211。用？851'洗涤 酶标板3次，每次5min。力口 0、5、10、50和100 μ g/ml五个浓度梯度的SS12-FC和3SS12-FC 蛋白溶液，每个浓度3个平行，每孔50μ L，37°C，温育lh。Fc蛋白作为阴性对照，BCMA-Fc 作为阳性对照。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。每孔加1 :5000倍稀释的HRP标记羊 抗人抗体50 μ L，37°C，lh。用PBST洗涤3次，每次5min。每孔加入50 μ L TMB显色液，37°C 避光显色lOmin。每孔加50 μ Llmol/L H2S04终止反应，酶标仪检测0D450值。SS12-Fc和 3SS12-Fc融合蛋白结合BLyS蛋白的活性由下述公式计算：结合率％ =实验组0D450/对照 组 0D450。
[0083] ELISA实验结果表明，SS12-FC浓度在5μ g/ml时与BLyS结合率为41. 7%;10μ g/ ml时与BLyS结合率为56. 9 % ;50 μ g/ml时与BLyS结合率为59. 46 %; 100 μ g/ml时与BLyS 结合率为57. 76%。结合程度与融合蛋白的浓度呈正相关。3SS12-Fc浓度在5μ g/ml时与 BLyS结合率为45. 1% ;10μ g/ml时与BLyS结合率为58. 67% ;50μ g/ml时与BLyS结合率 为76. 02 % ; 100 μ g/ml时与BLyS结合率为76. 72 %。结合程度与融合蛋白的浓度呈正相 关（见图9)。
[0084] 阴性对照Fc蛋白与BLyS没有明显的结合作用、且没有剂量依赖关系。阳性对照 BCMA-Fc蛋白与BLyS有结合，且结合程度与融合蛋白浓度呈正相关。因此证明SS12-FC和 3SS12-FC的结合作用是特异和有效的。
[0085] 实施例5
[0086] ELISA实验验证SS12-FC和3SS12-FC融合蛋白的抑制活性
[0087] 1)用包被液稀释BLyS蛋白至终浓度为10yg/ml，取50yL于酶标板中，4°C，18h。 用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。每孔加150μ15%脱脂奶粉，37°C，温育2h。用PBST 洗涤酶标板3次，每次5min。将固定浓度的TACI-Fc-myc蛋白（终浓度为1 μ g/ml)与不 同浓度梯度的SS12-FC和3SS12-FC融合蛋白（终浓度分别为0、10、50和100μ g/ml)混 合，每个浓度3个平行，每孔加50μ L，37°C，温育lh。Fc蛋白作为阴性对照，TACI-Fc作为 阳性对照。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。每孔加1 :1000倍稀释的小鼠抗myc抗 体50yL，37°C，温育lh。用PBST洗涤3次，每次5min。每孔加1:5000倍稀释的山羊抗小 鼠抗体50yL，37°C，温育lh。每孔加入50yL TMB显色液，37°C避光显色lOmin。每孔加 50 μ Llmol/L H2S04终止反应，酶标仪检测0D450值。SS12-FC和3SS12-FC融合蛋白对BLyS 与TACI-Fc-myc的相互作用的抑制效果用下述公式计算：抑制率％=(对照组0D450-实 验组0D450) /对照组0D450。
[0088] 竞争ELISA实验结果表明：SS12-Fc浓度在5μ g/ml时能够抑制5. 26% BLyS与 TACI-Fc-myc的结合；在10 μ g/ml时能够抑制5. 76 % BLyS与TACI-Fc-myc的结合；在 50μ g/ml时能够抑制12. 95% BLyS与TACI-Fc-myc的结合；在ΙΟΟμ g/ml时能够抑制 24. 03% BLyS与TACI-Fc-myc的结合。抑制作用与融合蛋白的浓度呈正相关。
[0089] 3SS12-FC 浓度在 5 μ g/ml 时能够抑制 9. 96 % BLyS 与 TACI-Fc-myc 的结合； 在10 μ g/ml时能够抑制17. 02 % BLyS与TACI-Fc-myc的结合；在50 μ g/ml时能够抑 制 37. 24 % BLyS 与 TACI-Fc-myc 的结合；在 100 μ g/ml 时能够抑制 49. 97 % BLyS 与 TACI-Fc-myc的结合。抑制作用与融合蛋白的浓度呈正相关。（见图10)。
[0090] 阴性对照Fc蛋白对BLyS与TACI的相互作用没有明显抑制作用、且没有剂量依赖 关系。阳性对照TACI-Fc对BLyS与TACI的相互作用有明显抑制作用、且抑制程度与融合 蛋白浓度呈正相关。证明SS12-FC和3SS12-FC的抑制作用是特异和有效的。
[0091] 2)用包被液稀释BLyS蛋白至终浓度为lOyg/ml，取50yL于酶标板中，4°C，18h。 用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。每孔加150μ15%脱脂奶粉，37°C，温育2h。用PBST 洗涤酶标板3次，每次5min。将固定浓度的BCMA-Fc-myc蛋白（终浓度为1 μ g/ml)与不 同浓度梯度的SS12-FC和3SS12-FC融合蛋白（终浓度分别为0、10、50和ΙΟΟμ g/ml)混 合，每个浓度3个平行，每孔加50μ L，37°C，温育lh。Fc蛋白作为阴性对照，BCMA-Fc作为 阳性对照。用PBST洗涤酶标板3次，每次5min。每孔加1 :1000倍稀释的小鼠抗myc抗 体50μ L，37°C，温育lh。用PBST洗涤3次，每次5min。每孔加1 :5000倍稀释的山羊抗小 鼠抗体50yL，37°C，温育lh。每孔加入50yL TMB显色液，37°C避光显色10min。每孔加 50 μ Llmol/L H2S04终止反应，酶标仪检测0D450值。SS12-FC和3SS12-FC融合蛋白对BLyS 与BCMA-Fc-myc的相互作用的抑制效果用下述公式计算：抑制率％ =(对照组0D450-实 验组0D450) /对照组0D450
[0092] 竞争ELISA实验结果表明：SS12-Fc浓度在5μg/ml时能够抑制22%BLyS与 BCMA-Fc-myc的结合；在10 μ g/ml时能够抑制28. 1 % BLyS与BCMA-Fc-myc的结合；在 50 μ g/ml时能够抑制65. 39 % BLyS与BCMA-Fc-myc的结合；在100 μ g/ml时能够抑制 79. 64% BLyS与BCMA-Fc-myc的结合。抑制作用与融合蛋白的浓度呈正相关。
[0093] 3SS12-FC 浓度在 5 μ g/ml 时能够抑制 26. 6 % BLyS 与 BCMA-Fc-myc 的结合；在 10 μ g/ml时能够抑制34. 9 % BLyS与BCMA-Fc-myc的结合；在50 μ g/ml时能够抑制69. 6 % BLyS 与 BCMA-Fc-myc 的结合；在 100 μ g/ml 时能够抑制 80. 6% BLyS 与 BCMA-Fc-myc 的结 合。抑制作用与融合蛋白的浓度呈正相关（见图11)。
[0094] 阴性对照Fc蛋白对BLyS与BCMA-Fc-myc的相互作用没有明显抑制作用、且没有 剂量依赖关系。阳性对照BCMA-Fc对BLyS与BCMA-Fc-myc的相互作用有明显抑制作用、且 抑制程度与融合蛋白浓度呈正相关。证明SS12-FC和3SS12-FC的抑制作用是特异和有效 的。
【权利要求】
1. BLyS拮抗肽SS12,是用SEQ ID NO. 1所示。 2. BLyS 拮抗肽 3SS12,是用 SEQ ID NO. 2 所示。
3. 含BLyS拮抗肽SS12的融合蛋白SS12-Fc，是用SEQ ID NO. 3所示。
4. 含BLyS拮抗肽3SS12的融合蛋白3SS12-Fc，是用SEQ ID NO. 4所示。
5. 编码BLyS拮抗肽SS12的基因，其特征是用下述方法构建：以SEQ ID NO. 5所示序列 为上游引物，以SEQ ID NO. 6所示序列为下游引物，上、下游引物互补，通过变性、退火，配对 形成编码BLyS拮抗肽SS12的基因，所述编码BLyS拮抗肽SS12的基因如SEQ ID NO. 7所 /_J、1 ο
6. 编码融合蛋白SS12-Fc的基因，其特征是用下述方法构建，用限制性内切酶EcoRI 和Hind III酶切人IgGIFc DNA片段，回收630bp的Fc DNA片段，与权利要求5获得的编 码BLyS拮抗肽SS12的基因连接，得到编码融合蛋白SS12-FC的基因，所述编码融合蛋白 SS12-FC的基因如SEQ ID NO. 8所示。
7. 含编码融合蛋白SS12-FC基因的质粒，其特征是用下述方法构建，用限制性内切酶 Ndel和Hind III酶切载体pET30a，回收酶切后pET30a片段，与权利要求6获得的编码融 合蛋白SS12-FC的基因加入T4连接酶，进行连接反应制成含编码融合蛋白SS12-FC基因的 质粒 SS12-Fc-pET30a。
8. 编码BLyS拮抗肽3SS12的基因，其特征是用下述方法构建：含有编码BLyS拮抗肽 3SS12的基因的质粒3SS12-pUC19 (由鼎国生物技术公司合成），用Ndel和EcoRI酶切获得 编码BLyS拮抗肽3SS12的基因，所述编码BLyS拮抗肽3SS12的基因如SEQ ID NO. 9所示。
9. 编码融合蛋白3SS12-FC的基因，其特征是用下述方法构建，用限制性内切酶EcoRI 和Hind III酶切人IgGlFcDNA片段，回收630bp的Fc DNA片段，与权利要求8获得的编 码BLyS拮抗肽3SS12的基因连接，得到编码融合蛋白3SS12-FC的基因，所述编码融合蛋白 3SS12-FC 的基因如 SEQ ID NO. 10 所示。
10. 含编码融合蛋白3SS12-FC基因的质粒，其特征是用下述方法构建，用限制性内切 酶Ndel和Hind III酶切pET30a，回收酶切后pET30a片段，与权利要求9获得的编码融合 蛋白3SS12-FC的基因加入T4连接酶，进行连接反应制成含编码融合蛋白3SS12-FC基因的 质粒 3SS12-Fc-pET30a。
【文档编号】C07K7/08GK104193806SQ201410400425
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月14日 优先权日:2014年8月14日
【发明者】孙剑, 冯建男, 臧孟存, 沈倍奋 申请人:天津大学