专利名称：利用内含肽反式剪接模式化生产融合蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种模式化生产重组融合蛋白质的方法，可用于基因工程、酶的生产、 医药生产、食品工业和农牧业等领域。
背景技术：
1、内含肽介导的反式剪接原理蛋白质内含肽(intein)是寄生在其它蛋白质中的一段多肽链。其编码DNA序列 与正常蛋白的外显子一起转录和翻译，产生一条多肽链。然后从中切除与内含肽对应的序 列，再把被寄生蛋白质的序列连接起来，成为有功能的蛋白质。这是一种蛋白质的自我剪 接机制。一般来说，蛋白质内含肽有10个模体(motif)，顺序依次为n’ -an2bn4cdehfg-c’， 其中A、N2, B、N4、F、G属于自我剪接域的模体，而C、D、E、H属于归位核酸内切酶域的模体 (Perler FBiOlsen GJiAdam E. Compilation and analysis of intein sequences. Nucleic Acids Res. 1997，25(6) 1087 ；PerlerFB.InBase :the Intein Database. NucleicAcids Res. 2002,30(1) :383)。对于内含肽行使剪接功能来说，归位核酸内切酶结构域并不是必须 的。蓝藻Synechocystis sp. PCC6803 的 DNA 聚合酶 III 的 α 亚基(DnaE)，分成两段， dnaE-n基因编码前774个氨基酸，dnaE-c基因编码后423个氨基酸，这两段间隔745kb。它 们分别表达后，通过内含肽的相互识别，反式剪接到一起形成完整功能蛋白(见
图1)。(Sim W, Yang J, Liu XQ. Synthetic two-piece and three-piece split inteins for protein trans-splicing. J Biol Chem. 2004,279(34) :35281)。2、融合蛋白的概念及常规生产方法融合蛋白(fusion protein)通常由两部分组成，即有特定生物学功能的目的蛋白 部分与通用功能的辅助蛋白部分组成。基因工程中经常要生产多部分组成的融合蛋白，例 如GFP (绿色荧光蛋白)融合蛋白、GST (谷胱甘肽S-转移酶)融合蛋白、CTB (霍乱毒素B 亚单位)融合蛋白、His-tag融合蛋白等。将两个不同的蛋白质连成一个大分子，现有两种 方法，即基因融合法和化学融合法两种。这两种方法都有其不足之处。基因融合法是将目的蛋白与辅助蛋白的编码基因融合，在同一宿主生物中表达。 它有以下几点不足1)对于同一目的蛋白与多种辅助蛋白的组合，就要合成多种融合基 因，增加了许多工作量；2)融合基因长度较大，对基因工程中的种种操作，如载体构建、转 化、表达及纯化等都带来了更多的问题；3)融合基因被限制在单一宿主生物中表达，而融 合蛋白的两部分经常需要不同的宿主表达环境。化学融合法是将分别表达的目的蛋白与辅助蛋白混合在溶液中，加入特定的化学 交联物，将两个蛋白融合成一体。与基因融合法相比，它最大的优势在于只要通过一次基因 工程的方法生产出目的蛋白，就可以同多种辅助蛋白生成融合蛋白。对于生成同一目的蛋 白的多种融合蛋白，化学融合法较基因融合法要简便很多，但它也有非常大的缺陷1)化 学融合法的专一性很差，两个蛋白的整合位点不确定，有时还会导致目的蛋白内部与辅助蛋白内部的融合，所以最后所得到的融合蛋白产率很低，分离纯化也比较困难；2)有些辅 助蛋白，如6个氨基酸组成的His-tag，非常短，不能有效地通过基因工程生产，只能用化学 合成的方法生产，生产成本很高；3)化学融合法所使用的化学交联物经常是有毒有害的物 质，因此对生产环境提出很高的要求，增加生产成本，也对带来环境污染的不良后果；4)目 的蛋白与辅助蛋白的纯度都有很高要求，增加了两次纯化的步骤，提高生产成本。
发明内容
1、发明目的本发明主要是利用内含肽反式剪接将有特定生物学功能的目的蛋白部分与通用 功能的辅助蛋白连接在一起，从而得到融合蛋白质。利用内含肽反式剪接得到融合蛋白的方法，选择目的蛋白T，辅助蛋白P1、P2，两 种互不兼容的内含肽A和B (如蓝藻Synechocystis sp. PCC6803的DnaE和DnaB)，将内含 肽A和B分别分解为氨基末端(N端)与羧基末端(C端)，即An、Ac、Bru Be。构建不同的 载体系统分别经宿主表达后得到蛋白片段AC-T-Bn，Pl-An，BC-P2，An，BC。将得到的蛋白片 段混合，进行内含肽反式剪接，生成融合蛋白P1-T-P2，Pl-T或T-P2。2、实施方式如下1)首先构建三个基础质粒载体载体pt的构成按顺序为启动子、内含肽A的羧基 端编码序列、多克隆位点、内含肽B的氨基端编码序列、终止子；载体pi的构成按顺序为启 动子、多克隆位点、内含肽A的氨基端编码序列、终止子；载体p2的构成按顺序为启动子、内 含肽B的羧基端编码序列、多克隆位点、终止子。2)将选定的目的蛋白T，辅助蛋白PI、P2插入到载体中将目的蛋白T的编码序 列，插入到载体Pt中，得到的载体PT ；将辅助蛋白Pl的编码序列，插入到载体Pl中，得到 的载体PPl ；将辅助蛋白P2的编码序列，插入到载体p2中，得到的载体pP2。3)将载体pT、载体pPl、载体pP2、载体pi、载体p2分别转化到适宜的宿主中，分别 表达，得到蛋白 Ac-T-Bn，Pl-An, Bc_P2，An，Be。4)要得到融合蛋白P1-T-P2，则将蛋白片段Ac-T-Bn、Pl-An和Bc_P2混合。通过 内含肽A的反式剪接，将Pl与T融合，通过内含肽B的反式剪接，将T与P2融合。形成所 要融合蛋白P1-T-P2。5)要得到融合蛋白Pl-Τ，则将蛋白片段Ac-T-Bn、Pl-An和Bc混合。通过内含肽 A的反式剪接，将Pl与T融合，通过内含肽B的反式剪接，将Bn从T上剪下。形成所要融合 蛋白P1-T。6)要得到融合蛋白T-P2，则将蛋白片段Ac-T-BruBc-T和An混合。通过内含肽A 的反式剪接，将Bc从T上剪下，通过内含肽B的反式剪接，将T与P2融合。形成所要融合 蛋白T-P2。3、本发明的优势本发明提出了一种利用内含肽反式剪接模式化生产融合蛋白的新方法，克服了基 因融合法与化学融合法的不足之处，拥有如下的优点1)只需要通过一次基因工程的方法 生产出目的蛋白，就可以同多种辅助蛋白生成融合蛋白；2)基因长度较小，简化了基因工 程中的各个操作流程；3)目的蛋白与辅助蛋白可以分开表达，比如需要特殊折叠环境、特别翻译后修饰的目的蛋白，就可以在哺乳动物细胞里表达，而没有太多要求的辅助蛋白则 可以在简单的大肠杆菌中表达；4)目的蛋白与辅助蛋白的整合位点唯一确定，不会生成副 产物；5)因为辅助蛋白是同内含肽的一段融合表达的，因此非常小的辅助蛋白，也能通过 基因工程的方法有效生产；6)生产过程中没有使用任何有毒有害的物质；7)对目的蛋白与 辅助蛋白的纯度都没有要求，甚至可以使用粗细胞破碎产物，降低了生产成本。图1A)图示；B)形成融合蛋白P1-T-P2的方法；C)形成融合蛋白P1-T的方法；D) 形成融合蛋白T-P2的方法。图2内含肽介导的反式剪接示意图。N表示DnaE的N端及其编码基因的5’端， In表示内含肽的N端及其编码部分的5’端，C表示DnaE的C端及其编码基因的3’端，Ic 表示内含肽的C端及其编码部分的3’端。
具体实施例方式下面通过实施例，对本发明的方法方案作进一步具体的说明。1) _ 力 J 木干胃 Escherichia coli str. K-12substr. MG1655 白勺 beta-D-glucuronidase基因所编码的的蛋白⑶S，作为目的蛋白Τ。具体序列见NCBI Reference Sequence NP_416134. 1。2)选择蓝藻 Synechocystis sp. PCC6803 的 DnaE 内含肽和 DnaB 内含肽(http:// www. neb. com/neb/inteins. html)。DnaE 内含肽氨基端序列如下CLSFGTEILT VEYGPLPIGK IVSEEINCSV YSVDPEGRVY TQAIAQffHDR GEQEVLEYEL EDGSVIRATS DHRFLTTDYQ LLAIEEIFAR QLDLLTLENI KQTEEALDNH RLPFPLLDAG TIK。DnaE 内含肽羧基端序列如下MVKVIGRRSLGVQRIFDIGLPQDHNFLLANGAIAAN。DnaB 内含肽序列如下CISGDSLISL ASTGKRVSIK DLLDEKDFEI WAINEQTMKL ESAKVSRVFC TGKKLVYILK TRLGRTIKAT ANHRFLTIDG WKRLDELSLK EHIALPRKLE SSSLQLMSDE ELGLLGHLIG DGCTLPRHAI QYTSNKIELA EKVVELAKAV FGDQINPRIS QERQffYQVYI PASYRLTHNK KNPITKffLEN LDVFGLRSYE KFVPNQVFEQ PQRAIAIFLR HLffSTDGCVK LIVEKSSRPV AYYATSSEKL AKDVQSLLLK LGINARLSKI SQNGKGRDNY HVTITGQADL QIFVDQIGAV DKDKQASVEE IKTHIAQHQA NTNRDVIPKQ IffKTYVLPQI QIKGITTRDL QMRLGNAYCG TALYKHNLSR ERAAKIATITQSPEIEKLSQ SDIYffDSIVS ITETGVEEVF DLTVPGPHNF VANDIIVHN。牛艮据文献 艮道(Sun W, Yang J, Liu XQ. Synthetic two-piece and three-piece split inteins for protein trans-splicing. J Biol Chem. 2004,279(34) :35281), 将DnaB内含肽两端序列切下，氨基端序列如下CISGDSLISL ASTGKRVSIK DLLDEKDFEI WAINEQTMKL ESAKVSRVFC TGKKLVYILK TRLGRTIKAT ANHRFLTIDG WKRLDELSLK EHIALPRKLE SSSLQ0 羧基端序列如下LSPEI EKLSQSDIYff DSIVSITETG VEEVFDLTVP GPHNFVANDI IVHN。3)选择GST(谷胱甘肽S-转移酶)，作为辅助蛋白PI。4)选择His-tag(六个连续的组氨酸)作为辅助蛋白P2。5)使用一个常用的带有多克隆位点的质粒，如pET_41a(+)，按次序，将DnaE内含 肽羧基端编码序列插入到该质粒的NdeI与EcoRV位点间，将DnaB内含肽氨基端编码序列 插入到该质粒的HindIII与XhoI位点间。形成载体Pt。
6)将⑶S蛋白的编码序列插入到载体pt的BamHI与SalI位点间。形成载体pT。7)使用一个常用的带有多克隆位点的质粒，如pET_41a(+)，将DnaE内含肽氨基端 编码序列用长引物PCR法在5’端加上多克隆位点后，插入到该质粒的NdeI与XhoI位点间。 形成载体pi。它的构成按顺序为启动子、多克隆位点、内含肽A的氨基端编码序列、终止子。8)从一个常用的带有GST的质粒，如pET_41a(+)，用NdeI与SpeI将GST的编码 序列切下，插入到载体Pi中。得到载体pPi。9)使用一个常用的带有多克隆位点的质粒，如pET_41a(+)，将DnaB内含肽羧基端 编码序列用长引物PCR法在3’端加上多克隆位点后，插入到该质粒的NdeI与XhoI位点间。 形成载体p2。它的构成按顺序为启动子、内含肽B的氨基端编码序列、多克隆位点、终止子。10)设计一对互补的引物，使其含有编码His-tag及终止密码子，将引物退火形成 一个DNA接头，再把它插入到载体p2中。形成载体pP2。11)将载体pT、载体pPl、载体pP2、载体pi、载体p2分别转化到表达菌株E. coli str. BL21(DE3)中，分别表达、纯化，得到蛋白Ac-T-Bn，Pl-An, Bc_P2，An, Be，它们分别是 DnaEc-T-DnaBn, GST-DnaEn, DnaBc-His, DnaEn,DnaBc ；12)要得到融合蛋白P1-T-P2，则将蛋白片段Ac-T-BruPl-An和Bc_P2混合。通过 内含肽A的反式剪接，将Pl与T融合，通过内含肽B的反式剪接，将T与P2融合。形成所 要融合蛋白P1-T-P2，即GST-⑶S-His。13)要得到融合蛋白Pl-Τ，则将蛋白片段Ac-T-BruPl-An和Bc混合。通过内含肽 A的反式剪接，将Pl与T融合，通过内含肽B的反式剪接，将Bn从T上剪下。形成所要融合 蛋白 Pl-Τ，即 GST-GUS。14)要得到融合蛋白T-P2，则将蛋白片段Ac-T-Bn、Bc-T和An混合。通过内含肽 A的反式剪接，将Bc从T上剪下，通过内含肽B的反式剪接，将T与P2融合。形成所要融合 蛋白 T-P2 即 GUS-HiS。
权利要求
利用内含肽反式剪接模式化生产融合蛋白质的方法，选择目的蛋白T，辅助蛋白P1、P2，两种互不兼容的内含肽A和B，将内含肽A和B分别分解为氨基末端(N端)与羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc。构建不同的载体系统分别经宿主表达后得到蛋白片段Ac T Bn，P1 An，Bc P2，An，Bc，将得到的蛋白片段混合，进行内含肽反式剪接，生成融合蛋白P1 T P2，P1 T或T P2。
2.五种非天然形成的蛋白分子，其特征在于1)一种非天然形成的蛋白分子，其特征在于该蛋白包含断裂内含肽A的羧基端部分， 目的蛋白T和断裂内含肽B的氨基端部分；2)一种非天然形成的蛋白分子，其特征在于该蛋白包含辅助蛋白Pl和断裂内含肽A的 氨基端部分；3)一种非天然形成的蛋白分子，其特征在于该蛋白包含包含断裂内含肽B的羧基端和 辅助蛋白P2;4)一种非天然形成的蛋白分子，其特征在于该蛋白包含断裂内含肽A的氨基端部分；5)一种非天然形成的蛋白分子，其特征在于该蛋白包含包含断裂内含肽B的羧基端。
3.三种非天然的质粒载体，其特征在于1)载体Pt的构成按顺序为启动子、内含肽A的羧基端编码序列、多克隆位点、内含肽B 的氨基端编码序列、终止子；2)载体pi的构成按顺序为启动子、多克隆位点、内含肽A的氨基端编码序列、终止子；3)载体p2的构成按顺序为启动子、内含肽B的羧基端编码序列、多克隆位点、终止子。
4.三种非天然的质粒载体，其特征在于1)将目的蛋白T的编码序列，插入到如权利要求3.1的载体pt中，得到的载体pT ；2)将辅助蛋白Pl的编码序列，插入到如权利要求3.2的载体pi中，得到的载体pPl ；3)将辅助蛋白P2的编码序列，插入到如权利要求3.3的载体p2中，得到的载体pP2。
5.根据权利要求1所述，形成融合蛋白P1-T-P2的方法，其特征在于如权利要求4.1、 4. 2、4. 3得到的载体，分别表达，得到如权利要求2. 1,2. 2.、2. 3的蛋白。将产生的蛋白片段 混合后，通过内含肽反式剪接，形成所要融合蛋白P1-T-P2。
6.根据权利要求1所述，形成融合蛋白Pl-T的方法，其特征在于如权利要求4.1、 4. 2、3. 3得到的载体，分别表达，得到如权利要求2. 1,2. 2.、2. 5的蛋白。将产生的蛋白片段 混合后，通过内含肽反式剪接，形成所要融合蛋白P1-T。
7.根据权利要求1所述，形成融合蛋白T-P2的方法，其特征在于如权利要求4.2、 4. 3、3. 2得到的载体，分别表达，得到如权利要求2. 1,2. 3.、2. 4的蛋白。将产生的蛋白片段 混合后，通过内含肽反式剪接，形成所要融合蛋白T-P2。
8.根据权利要求1所述的利用内含肽反式剪接模式化生产融合蛋白质的方法，其特征是选择大肠杆菌Escherichia coli K12的uidA基因所编码的的蛋白⑶S，作为目的蛋白 T ；选择GST (谷胱甘肽S-转移酶)，作为辅助蛋白Pl ；选择His-tag (六个连续的组氨酸) 作为辅助蛋白P2 ；另选择蓝藻Synechocystis sp. PCC6803的DnaE和DnaB分别作为内含 肽A和B。将内含肽A和B分别分解为氨基末端(N端)与羧基末端(C端)，即An、AC、Bn、 Be。然后将它们组成五个重组蛋白，即Ac-T-Bn, Pl-An, Bc-P2, An, Be,它们分别是 DnaEc-GUS-DnaBn, GST-DnaEn, DnaBc-His, DnaEn, DnaBc ；首先让蛋白DnaEc-GUS-DnaBn、GST-DnaEn和DnaBc-His反应，可以得到融合蛋白 GST-GUS-His ；首先让蛋白DnaEc-GUS-DnaBruGST-DnaEn和DnaBc反应,可以得到融合蛋白GST-GUS ； 首先让蛋白DnaEc-GUS-DnaBruDnaEn和DnaBc-His反应，可以得到融合蛋白GUS_His。
全文摘要
本发明公开了一种利用内含肽反式剪接模式化生产融合蛋白质的方法，可用于基因工程、酶的生产、医药生产、食品工业和农牧业等领域。本发明主要是利用内含肽反式剪接将有特定生物学功能的目的蛋白部分与通用功能的辅助蛋白连接在一起，从而得到融合蛋白质。选择目的蛋白T，辅助蛋白P1、P2，两种互不兼容的内含肽A和B(如蓝藻Synechocystis sp.PCC6803的DnaE和DnaB)，将内含肽A和B分别分解为氨基末端(N端)与羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc。构建不同的载体系统分别经宿主表达后得到蛋白片段Ac-T-Bn，P1-An，Bc-P2，An，Bc。将得到的蛋白片段混合，进行内含肽反式剪接，生成融合蛋白P1-T-P2，P1-T或T-P2。
文档编号C07K14/405GK101899489SQ200910027339
公开日2010年12月1日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者丁静, 刘静, 吴娟子, 张鹏飞, 王强, 王斌, 袁慧中, 陈建群 申请人:南京大学