专利名称：融合肽治疗组合物的制作方法
技术领域：
本发明提供掺入了包含弹性蛋白样肽(elastin-like peptides, ELPs)和肽活性治疗剂的融合蛋白(fusion proteins,FPs)的新一代治疗组合物。本发明的治疗组合物与含有相同肽活性治疗剂但不含与之结合的ELPs的相应组合物相比，能使所给予的肽活性治疗剂的溶解度、生物利用度或生物不可利用度(bio-unavailability)和半寿期的提高得以实现。
背景技术：
为所有目的，将2005年2月8日授权的、Ashutosh Chilkoti名下的题为“FUSIONPEPTIDES ISOLATABLE BY PHASE TRANSITION”(可通过相转变分离的融合肽)”的美国专利第6，852，834号和2005年2月8日提交的Ashutosh Chilkoti名下的题为“FUSIONPEPTIDES ISOLATABLE BY PHASE TRANSITION”(可通过相转变分离的融合肽)”的美国专利申请第11/053，100号的公开内容各自通过引用整体结合到本文中。上述Chilkot i的专利和专利申请公开了包含ELP肽的遗传上可编码的环境响应性融合蛋白。这种融合蛋白显示出独特的物理化学特性和功能特性，这些特性可随溶液环境变化来进行调节。
发明内容
本发明主要涉及包含弹性蛋白样肽和肽活性治疗剂的融合蛋白治疗组合物。在本发明的FP治疗组合物中，有至少一个肽活性治疗剂与一个或多个ELPs偶联(coupled)，例如在其N末端或C末端共价键合，以实现肽活性治疗剂的功效的增强，这一增强是相对于相应的单独治疗剂而言。肽活性治疗剂-ELP构建物功效的增强表现在多个特性的任何一个，如所给予的肽活性治疗剂的溶解度、生物利用度、生物不可利用度、治疗剂量、对蛋白水解的抗性、半寿期等。在另一个方面，本发明涉及包含与表达控制元件如适当类型的启动子可操作地连接(operably linked)的异源核苷酸序列的融合基因构建物,其中异源核苷酸序列编码包含与至少一个ELP偶联的至少一种肽活性治疗剂的融合蛋白。在又一个方面，本发明涉及增强肽活性治疗剂的功效的方法。所述方法包括将肽活性治疗剂与至少一个ELP偶联以形成FP治疗组合物，其中这种FP治疗组合物中的肽活性治疗剂相对于单独的肽活性治疗剂来说具有增强的功效。在一个方面，增强的功效是体内功效。本发明的另一个方面涉及治疗需要肽活性治疗剂的受试者的方法，所述方法包括给予该患者包含以下的治疗组合物:(i)与至少一个ELP偶联的肽活性治疗剂，或(ii)编码包含肽活性治疗剂和至少一个ELP的融合蛋白的核苷酸序列，这个序列可操作地连接到其表达控制元件。在还另一个方面，本发明涉及其中治疗剂与ELP缀合(conjugate)的治疗剂剂型。由下续的公开内容和所附的权利要求书，可更加清楚地了解本发明各个其他的方面、特征和实施方案。
图1是SDS-PAGE凝胶图，显示了使用实施例1的表达和纯化方法进行的37个氨基酸的肽的表达情况。图例:M =分子量标记；S =超声处理后的裂解物；P =离心所得的沉淀(转变前);L =可溶性裂解物；Tn =第η次转变所得的沉淀图2是 曲线图，证实了实施例1的方法所得的肽的纯化。图3是SDS-PAGE凝胶图，显示了实施例6所述的BFP、CAT和Κ1-3的ITC纯化的结果。图4Α和4Β是曲线图，显示了实施例8的每个融合构建物在PBS缓冲液中作为温度函数的浊度的增加。图5是曲线图，说明了实施例9所述的14C标记ELP的血液浓度与时间的变化关
系O图6是柱图，显示了实施例10所述的14C标记ELP1-150和ELP2-160在裸鼠中的生物分布。图7是柱图，显示了实施例10所述的14C标记ELP2-[V1A8G7-WO]在裸鼠中的生物分布。
具体实施例方式本发明提供掺入了包含弹性蛋白样肽和肽活性治疗剂的融合蛋白的治疗组合物。本发明的治疗组合物与含有相同肽活性治疗剂但不含与之结合的ELPs的相应组合物相比，能使所给予的肽活性治疗剂的功效的提高得以实现，所述功效的提高例如溶解度、生物利用度、生物不可利用度(在需要避免出现蓄积和/或毒性如心脏毒性的情况下)、半寿期等的改进。为在后续的说明中便于查考，以下给出在其中出现的具体术语的定义。术语“蛋白(质)”在本文中以一般性含义使用，包括任何长度的多肽。本文所用的术语“肽”要作广义解释，包括分子量最高达约10，000的多肽本身，以及分子量超过约10，000的蛋白质，其中分子量是数均分子量。在一个具体的方面，具有约2至约100个氨基酸残基的肽特别优选作为本发明的肽活性治疗剂。
本文所用的术语“偶联”意指各指定部分(specified moieties)相互间直接发生共价键合，或者它们相互间通过一个或多个间插部分(intervening moiety)例如桥(bridge)、间隔序列(spacer)或键(linkage)部分间接发生共价连接,或者它们相互间通过例如氢键键合、离子键合、范德华力等发生非共价偶联。本文所用的术语“半寿期”意指活性剂的生物活性出现50%减低所需的时间。这个术语要与“持续期”和“清除率”区别开来，持续期是活性剂在身体内的总持续时间，清除率是一个动态变化的变量，可与半寿期和持续期的数值有关联或没有关联。词语“转化”在本文中作广义使用，指通过任何本领域公知的方法(包括例如来自细胞或病毒颗粒的多核苷酸序列的直接传导及通过感染性病毒颗粒的传导)将外源多核苷酸序列导入到原核生物或真核生物细胞中，导致无限增殖化或非无限增值化细胞系的基因型的永久或暂时改变。术语“功能等同物”在本文中用来指作为天然蛋白质的活性类似物、衍生物、片段、截短同种型等的蛋白质。某多肽当它保持了相应天然多肽的一些或全部生物活性时是有活性的。本文所用的本发明制剂的“药物可接受”成分(如盐、载体、赋形剂或稀释剂)是这样的成分，它(I) 与制剂的其他成分相容，表现在它能与本发明的FPs结合在一起又不会消除FPs的生物活性；和(2)适合在动物(包括人)中使用而不会产生过度的不利副作用(如毒性、刺激和过敏反应)。副作用在药物组合物的风险大于它们所提供的好处时是“过度”的。药物可接受成分的实例包括但不限于任何标准的药物载体如磷酸缓冲盐溶液、水、乳液如油/水乳液、微乳液和各种类型的湿润剂。本文所用的涉及蛋白质的术语“天然”表示该蛋白质具有自然界中所存在的相应蛋白质的氨基酸序列。本文所用的术语“间隔序列”指任何可插入在给定的ELP/肽活性治疗剂构建物中的ELP和肽活性治疗剂之间的部分。例如，间隔序列可以是在一个末端与ELP共价键合、在另一个末端与肽活性治疗剂共价键合的二价基团。因此，ELP/肽活性治疗剂构建物能纳入任何另外的不会妨碍ELP/肽活性治疗剂构建物用于其预定用途的功效的化学结构。间隔序列例如可以是提供来控制ELP/肽活性治疗剂构建物的药代动力学的蛋白酶敏感性间隔序列部分，或者它可以是蛋白酶不敏感性ELP/肽活性治疗剂构建物。本发明的融合蛋白(FP)治疗组合物包含与至少一个肽活性治疗剂偶联的至少一个弹性蛋白样肽(ELP)。组合物的ELP成分和肽活性治疗剂成分可以以任何合适的方式互相偶联，包括共价键合、离子键合、缔合键合(associative bonding)、复合或者任何其他的能有效地使ELP成分和肽活性治疗剂成分聚集在一起的偶联方式，使得肽活性治疗剂对其预定用途是有效的，并使得偶联的ELP的存在能在一些功能上的、治疗上的或生理上的方面对组合物中的肽活性治疗剂进行增强，以使它比单独的肽活性治疗剂更加有效。因此，FP治疗组合物中的ELP偶联肽活性治疗剂可在任何其他的特性方面得到增强，例如它的生物利用度、生物不可利用度、治疗剂量、制剂相容性、对蛋白水解或其他降解方式的抗性、溶解度、给予后在身体内的半寿期或持续期的其他量度方式、给予后从身体的清除率等。在本发明的FP治疗组合物中，有至少一个肽活性治疗剂与一个或多个ELPs偶联，例如在其N末端或C末端共价键合，以实现肽活性治疗剂的功效的增强，这一增强是相对于相应的单独治疗剂而言。本发明的FP治疗组合物可直接进行治疗给予，或者在体内从相应的融合基因构建物产生，所述融合基因构建物包含与表达控制元件如适当类型的启动子可操作地连接的异源核苷酸序列的融合基因构建物，其中异源核苷酸序列编码包含与至少一个ELP偶联的至少一种肽活性治疗剂的融合蛋白。本发明例如通过将肽活性治疗剂与至少一个ELP偶联形成FP治疗组合物，来使肽活性治疗剂的功效得到增强，其中这种FP治疗组合物中的肽活性治疗剂相对于单独的肽活性治疗剂而言具有增强的功效。本发明可用任何合适的包含与至少一个ELP偶联的至少一种肽活性治疗剂的治疗剂型来实施。本发明通过将肽活性治疗剂与至少一个ELP偶联形成FP治疗组合物，来使肽活性治疗剂能对蛋白水解降解保持稳定。本发明的FP治疗组合物可包含一个或多个ELP种类和一种或多种肽活性治疗剂。如上所述，各个ELP种类和肽活性治疗剂可直接相互偶联，或者这种偶联可通过构建物中包含间插在ELP和肽活性治疗剂之间的间隔序列部分来实现。本发明的FP治疗组合物中所用的ELP种类可以是任何合适的类型。ELPs是已被发现存在于弹性蛋白中的重复肽序列。这些重复肽序列包括聚四肽、聚五肽、聚六肽、聚七肽、聚八肽和聚九肽。
ELPs会发生可逆的反温度转变(inverse temperature transition)。在低于转变温度(Tt)下它们在水中是结构上无序的和高度可溶的，但当温度升高到Tt以上时会显示急剧的(2-3°C范围)从无序到有序的相转变(phase transition),导致多肽的去溶剂化和聚集。ELP聚集体当达到足够的大小时，可容易地通过离心从溶液中移取和分离。这种相转变是可逆的，分离的ELP聚合物当在温度恢复到ELPs的Tt以下时可完全重溶于缓冲溶液中。在本发明的实施中，ELPs种类起到稳定或以别的方式改进治疗组合物中的肽活性治疗剂的作用。在将偶联的肽活性治疗剂-ELP构建物给予需要肽治疗剂的患者之后，肽活性治疗剂和ELP保持互相偶联，同时肽活性治疗剂具有治疗活性，例如具有治疗或预防疾病状态或生理状况的活性或者具有其他治疗干预活性。例如，本发明的治疗组合物中的ELPs可包含这样的ELPs，它们由包括但不限于以下的各种特征性四肽、五肽、六肽、七肽、八肽和九肽的多聚或寡聚重复单元(repeats)所形成:(a)四肽 Val-Pro-Gly-Gly，或者 VPGG(SEQ ID NO:1)；(b)四肽 IIe-Pro-Gly-Gly，或者 IPGG (SEQ ID NO:2)；(c)五肽 Val-Pro-Gly-X-Gly (SEQ ID NO:3),或者 VPGXG，其中 X 为任何天然或非天然氨基酸残基，且其中X任选在各个多聚或寡聚重复单元之间不相同；(d)五肽 Ala-Val-Gly-Val-Pro，或者 AVGVP (SEQ ID NO:4)；(e)五肽 IIe-Pro-Gly-Val-Gly，或者 IPGVG (SEQ ID NO:5)；(f)五肽 Leu-Pro-Gly-Val-Gly，或者 LPGVG(SEQ ID NO:6)；
(g)六肽 Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly，或者 VAPGVG (SEQ ID NO:7)；(h)八肽 Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly,或者 GVGVPGVG(SEQ ID NO:8)；(i)九肽 Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly，或者 VPGFGVGAG(SEQ ID NO:
9);和j)九肽 Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly，或者 VPGVGVPGG(SEQ ID NO:10)。其他大小和构造的任何其他多聚或寡聚重复单元，也可有效地应用于本发明的广泛实施中。在一个实施方案中，肽活性治疗剂-ELP构建物的中的ELP包括五肽Val-Pro-Gly-X-Gly的重复单元，其中X如上定义，且其中Val-Pro-Gly-X-Gly五肽单元与ELP的其他氨基酸残基的比例大于约75%，更优选大于约85%，还更优选大于约95%。本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物可用合成法(例如重组法)产生。在肽活性治疗剂-ELP构建物中，ELP可在肽活性治疗剂的C末端和/或N末端连接，且任选可有间隔序列存在，将ELP与肽活性治疗剂隔开。在一个方面，本发明构思了包含编码肽活性治疗剂-ELP融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，所述融合蛋白任选包含如上所述的将ELP与肽活性治疗剂隔开的间隔序列。该多核苷酸可作为表达载体的成分提供。本发明还构思了被这种表达载体转化以表达融合蛋白的宿主细胞(原核细胞或真核细胞)。肽活性治疗剂-ELP构建物在合成或表达后，可通过涉及产生相转变的方法来进行分离，相转变例如是通过提高温度或通过其他方式来进行，从而造成在介质(medium)中以非分离形式存在的融合蛋白的相转变。例如，肽活性治疗剂-ELP构建物可通过如下步骤来合成和回收:构建包含编码能显示相转变的肽活性治疗剂-ELP融合蛋白的核苷酸序列的多核苷酸，在培养物中表达融合蛋白，和使培养物的含有融合蛋白的材料进行包括分离(例如通过离心、膜分离等进行分离)和反转变循环(inverse transition cycling, ITC)的处理以回收肽活性治疗剂-ELP融合蛋白。在一个具体的实施方案中，肽活性治疗剂-ELP融合蛋白包括这样的ELP部分，它包含选自 VPGG、IPGG、AVGVP, IPGVG、LPGVG, VAPGVG, GVGVPGVG、VPGFGVGAG 和 VPGVGVPGG 的
多肽的多聚或寡聚重复单元。在另一个具体的实施方案中，肽活性治疗剂-ELP融合蛋白包括这样的ELP部分，它包含选自LPGXG(SEQ ID NO: 11)、IPGXG(SEQ ID NO:12)和它们的组合的多聚或寡聚重复单元，其中X为不会妨碍ELP融合蛋白的相转变的氨基酸残基。本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物包含能给构建物赋予相转变特征的氨基酸序列。肽活性治疗剂-ELP构建物中的ELP可包含β -转角成分。适合用作β _转角成分的多肽的实例在Urry等人的国际专利申请PCT/US96/05186中有描述。或者，肽活性治疗剂-ELP中的ELP可以是缺乏β -转角成分或另外具有不同的构象和/或折叠特性的成分。如所述，ELPs可包括各种四肽、五肽、六肽、七肽、八肽和九肽的多聚或寡聚重复单元，这些肽包括但不限于 VPGG、IPGG、VPGXG, AVGVP, IPGVG、LPGVG, VAPGVG, GVGVPGVG、VPGFGVGAG和VPGVGVPGG (SEQ NO:1至SEQ NO:10)。本领域技术人员会认识到，ELPs并不需要仅由以上所列的多聚或寡聚序列组成，以显示相转变或另外构成适用于本发明肽活性治疗剂-ELP构建物的ELPs种类。在一个实施方案中，肽活性治疗剂-ELP构建物包括这样的ELPs，它是五肽VPGXG(SEQ ID NO:3)的多聚或寡聚重复单元，其中客体残基(guest residue)X为任何不会消除ELP的相转变特征的氨基酸。X可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。例如，X可选自以下:丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。在一个具体的实施方案中，X不是脯氨酸。X可以是非传统氨基酸。非传统氨基酸的实例包括:普通氨基酸的D-异构体、2，4- 二氨基丁酸、α -氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2_氨基丁酸、Y -Abu, ε -Ahx,6-氨基己酸、Aib,2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、丙氨酸、氟氨基酸、设计氨基酸(designer amino acid)如β _甲基氨基酸、C α -甲基氨基酸、Na-甲基氨基酸和全体氨基酸类似物。在每次ELP重复中，X的身份的选择是独立的。选择可基于任何所需的特征，如考虑到X位置中的带正电荷残基或带负电荷残基。可以认为，在X位置中具有中性值(neutralvalue)的ELPs可具有较长的半寿期。
在另一个实施方案中，肽活性治疗剂-ELP构建物包括这样的ELPs，它是五肽IPGXG(SEQ ID NO:11)或LPGXG(SEQ ID NO:12)的多聚或寡聚重复单元，其中X如上所定义。ELP序列的多聚或寡聚重复单元可被一个或多个不会消除肽活性治疗剂-ELP构建物的总体相转变特征的氨基酸残基隔开。在一个具体的实施方案中，当肽活性治疗剂-ELP构建物的ELP成分包含五肽VPGXG的多聚或寡聚重复单元时，VPGXG重复单元与ELP的其他氨基酸残基的比例大于约75%，更优选大于约85%，还更优选大于约95 %，最优选大于约99%。在每个重复单元中，X为独立进行选择。所产生的不同的ELPs种类在本文中用代号ELPk[X&-n]来区别，其中k表示ELP重复单元的具体类型，括号中的大写字母是单字母氨基酸代码，它们相应的下标表示每个客体残基X在重复单元中的相对比例，η以五肽重复单元的数目描述ELP的总长度。例如，ELPl [V5A2G3-1O]表示含有10个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X为缬氨酸、丙氨酸和甘氨酸，它们相对比例为5: 2: 3 ^LPUK1V2F1I]表示含有4个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X为赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，它们相对比例为1: 2:1 ；ELP1 [K1V7F1-Q]表示含有9个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X为赖氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，它们相对比例为1: 7: I ;ELPl[V-5]表示含有5个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X全部是缬氨酸；ELP1 [V-20]表示含有20个五肽VPGXG重复单元的多肽，其中X全部是缬氨酸；ELP2[5]表示含有5个五肽AVGVP重复单元的多肽；ELP3[V_5]表示含有5个五肽IPGXG重复单元的多肽，其中X全部是缬氨酸；ELP4[V-5]表示含有5个五肽LPGXG重复单元的多肽，其中X全部是缬氨酸。
Urry及其同事之前进行的研究证实，弹性蛋白五肽序列VPGXG中的第四个残基(X)可进行改变而又不消除β-转角的形成。这些研究还证实Tt是客体残基的疏水性的函数。通过改变客体残基的身份和它们的摩尔分数，可合成出在o-1oo°c范围内显示反转变的ELPs0在给定ELP长度下，可通过在ELP序列中掺入较大比例的疏水客体残基来降低Tt。合适的疏水客体残基的实例包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。也可使用中等疏水的酪氨酸。相反，可通过掺入选自以下的残基来提高Tt:谷氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、精氨酸和谷氨酰胺，优选丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和谷氨酸。在一个实施方案中，选择ELP以提供在如下范围内的Tt:约10至约80°C，更优选约35至约60°C，最优选约38至约45°C。Tt还可通过改变ELP链长度来改变。Tt随着分子量的下降而提高。对于分子量大于100，000的多肽，优选用Urry等人(PCT/US96/05186)开发的疏水性尺度来预测特定ELP序列的大约Tt。对于分子量小于100，000的多肽，优选用以下二次函数来确定Tt:Tt = Μο+Μ^+Μ^2其中X 为 FP 的分子量，且 M。= 116.21 !M1 = -1.7499 ；M2 = 0.010349。ELP的Tt和因 此ELP与肽活性治疗剂连接所成的构建物的Tt，受到客体残基X的身份和疏水性的影响，构建物的另外的特性也可能受到影响。这种特性包括但不限于ELP本身和构建物的溶解度、生物利用度或生物不可利用度和半寿期。在下文的实施例部分可知道，ELP偶联的肽活性治疗剂与游离蛋白质形式的这种治疗剂相比，保持了大部分 的治疗剂生物活性。另外，还证实ELPs显示长的半寿期。因此，可按照本发明将ELPs用来缀合治疗剂而极大地增加它的半寿期(相比于游离(未缀合)形式的治疗剂的半寿期，例如在具体的实施方案中增加10%、20%、30%、50%、100%、200%以上)。此外，还证实ELPs当进行体内给予时能靶向高血液含量的器官，因此可在身体中进行分配，以提供治疗剂在身体各个不同器官或区域当中的预定所需身体分布，或者提供治疗剂的所需选择性或靶向性。总之，本发明所构思的活性ELP-治疗剂缀合物，是作为具有长半寿期的位点特异性活性组合物来给予或在体内产生。在本发明的一个实施方案中，ELP长度为5至约500个氨基酸残基，更优选约10至约450个氨基酸残基，还更优选约15至约150个氨基酸残基。可通过在ELP序列中掺入较大比例的疏水客体残基，来减少ELP长度而同时又保持目标Tt。肽活性治疗剂-ELP构建物中的活性治疗剂可以是任何合适的类型。合适的肽包括在医学、农业及其他科学和工业领域中有意义的肽，特别包括治疗性蛋白质如促红细胞生成素、爪蟾抗菌肽、防御素、干扰素、胰岛素、单克隆抗体、血液因子、集落刺激因子、生长激素、白细胞介素、生长因子、治疗性疫苗、降钙素、肿瘤坏死因子(TNF)、受体拮抗齐U、皮质类固醇和酶类。这种肽的具体实例包括但不限于用于替代疗法的酶类；抗细菌肽；用于促进生长的激素和用于各种应用的活性蛋白质物质。具体的实例包括但不限于超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶(glutamase)、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(chromotrypsin)、木瓜蛋白酶(papin)、胰岛素、降钙素、ACTH、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)、somatosin、生长激素(somatropin)、生长调节素、甲状旁腺激素、促红细胞生成素(erthyropoietin)、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽和血管升压素。在本发明的一个实施方案中，肽活性治疗剂是硫氧还蛋白。在另一个实施方案中，肽活性治疗剂是淀粉酶抑肽。淀粉酶抑肽-ELP融合蛋白提供了作为α-淀粉酶抑制剂例如用于治疗胰腺炎的淀粉酶抑肽的容易分离的活性形式(version)。这个融合蛋白适于作为药物制剂的成分提供,它在药物制剂中与药物可接受载体相结合。淀粉酶抑肽-ELP融合蛋白保持了游离淀粉酶抑肽的大部分α-淀粉酶抑制活性，是稳定的构建物。在一个具体的实施方案中，肽活性治疗剂包括选自以下的生理活性肽:胰岛素、降钙素、ACTH、胰高血糖素、促生长素抑制素、促生长素、生长调节素、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽、血管升压素、非天然的阿片样物质(opiods)、超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶。本发明因此涵盖各种用于(体内)治疗应用的组合物，其中肽活性治疗剂-ELP构建物的肽成分是生理活性肽或生物活性肽。在这种含肽组合物的优选形式中，肽成分与ELP种类的偶联是通过直接共价键合或间接(通过适当的间隔基团)键合来实现的，肽部分和ELP部分可相互间以任何合适的涉及这种直接或间接共价键合的方式进行结构上的安排。因此，在本发明的广泛实施中有很多种肽可适用，在给定的治疗应用中可按要求或按需要选用。用作本发明肽活性治疗剂-ELP构建物中的肽活性治疗剂的肽，在一个实施方案中包括用于替代疗法的酶类和用于促进生长的激素。这种酶类包括超氧化物歧化酶、干扰素、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶(glutamase)、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶、核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶。在肽激素当中，适用于本发明肽活性治疗剂-ELP构建物的具体种类包括但不限于胰岛素、降钙素、ACTH、胰高血糖素、somatosin、生长激素 、生长调节素、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、下丘脑释放因子、催乳素、甲状腺刺激激素、内啡肽、脑啡肽和血管升压素。在另一个具体的方面，ELPs/肽活性治疗剂构建物中的肽活性治疗剂选自以下种类和它们所有的变体、片段和衍生物:刺鼠蛋白相关肽(agouti related peptide)、支链淀粉、血管紧张素、天蚕杀菌肽、铃蟾肽、胃泌素(包括胃泌素释放肽)、乳铁蛋白、抗微生物肽(包括但不限于爪蟾抗菌肽)、尿扩张素(urodilatin)、核定位信号(NLS)、胶原肽、存活蛋白、淀粉样肽(包括β_淀粉样肽)、利尿钠肽、肽YY、神经退行性肽和神经肽(包括但不限于神经肽Y)、强啡肽、内啡素、内皮素、脑啡肽、毒蜥外泌肽、纤连蛋白、神经肽W和神经肽S、肽Τ、黑皮质素、淀粉样蛋白前体蛋白、片层形成阻断肽(sheet breaker peptide)、CART肽、淀粉样蛋白抑制肽、朊病毒抑制肽、氯毒素、促肾上腺皮质激素释放因子、催产素、血管升压素、缩胆囊素、分泌素、胸腺素、表皮生长因子(EGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(TOGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、成纤维细胞生长因子(aFGF，bFGF)、胰抑制素、黑素细胞刺激激素、骨1丐蛋白、缓激肽、肾上腺髓质素、perinerin、metastatin、抑肽酶(apiOtinin)、甘丙肽(包括甘丙肽样肽)、瘦蛋白、防御素(包括但不限于α-防御素和β -防御素)、salusin和各种毒液(包括但不限于芋螺毒素、抗栓肽、kurtoxin、anenomae毒液和鸟蛛毒液)、利尿钠肽(包括脑利尿钠肽(B-型利尿钠肽或BNP)、心房利尿钠肽和血管钠肽)、神经激肽A、神经激肽B、神经调节肽、神经降压肽、食欲肽、胰多肽、垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)、催乳素释放肽、蛋白脂质蛋白质(PLP)、促生长素抑制素、TNF-α、Grehlin、蛋白质C(Xigris)、SSl (dsFv) -PE38和假单胞菌外毒素蛋白、凝血因子(包括抗凝血酶III和凝血因子VIIA、因子VII1、因子IX)、链激酶、组织型纤溶酶原激活齐U、尿激酶、葡糖脑苷脂酶和a-D-半乳糖苷酶、a-L-艾杜糖醛酸酶、α_1，4_葡糖苷酶、芳基硫酸酯酶B、艾杜糖-2-硫酸酯酶、脱氧核糖核酸酶1、人激活蛋白、卵泡刺激激素、绒毛膜促性腺激素、促黄体生成激素、生长激素、骨形态发生蛋白、奈西立肽、甲状旁腺激素、促红细胞生成素、角化细胞生长因子、人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、α-干扰素、干扰素、Y-干扰素、白细胞介素(包括IL-1、IL-1Ra, IL-2、ll-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-1U IL-12)、糖蛋白 ΙΙΒ/ΙΙΙΑ、免疫球蛋白(包括乙型肝炎球蛋白、Y -球蛋白、venoglobulin)、水蛭素、抑肽酶、抗凝血酶II1、α -1-蛋白酶抑制剂、非格司亭和依那西普。在另一个实施方案中，本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物的肽成分可以是涉及免疫疗法或其他治疗干 预的抗体或抗原。还将如下的各种其他的蛋白质和肽与不同的ELP多肽进行融合以形成能显示反相转变行为的FPs:胰岛素A肽、Τ20肽、干扰素ci2B肽、烟草蚀纹病毒蛋白酶、小异型二聚体伴侣孤儿受体、雄激素受体配体结合结构域、糖皮质类固醇受体配体结合结构域、雌激素受体配体结合结构域、G蛋白a Q、l-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶肽、G蛋白α S、血管生长抑素(Κ1-3)、蓝色荧光蛋白(BFP)、钙调蛋白(CalM)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、白细胞介素I受体拮抗剂(IL-1Ra)、萤光素酶、组织转谷氨酰胺酶(tTg)、吗啡调节神经肽(MMN)、神经肽Y(NPY)、食欲肽-B、瘦蛋白、ACTH、降钙素、肾上腺髓质素(AM)、甲状旁腺激素(PTH)、防御素和生长激素。作为活性治疗剂应用的各种蛋白质和肽，可在它们的一级结构、二级结构、三级结构、大小、分子量、溶解度、电荷分布、粘度和生物功能上有很大的不同。包含FPs的衍生物也包括在本发明的范围内，这些衍生物是在FPs合成过程中或合成后例如通过以下方法进行差异修饰得到的:苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、PEG化、通过已知的保护基团/封闭基团进行的衍生化、蛋白水解切割、与抗体分子或其他细胞配体的键合等。在一个实施方案中，FPs在N末端进行乙酰化和/或在C末端进行酰胺化。在另一个实施方案中，将FPs与聚合物缀合，所述聚合物例如本领域公知能促进多肽的口服递药、降低多肽的酶促降解、增加多肽的溶解度或者以别的方式改进治疗性多肽的化学特性以便给予人或其他动物的聚合物。本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物可通过公知的重组表达技术获得。为重组产生肽活性治疗剂-ELP构建物，将编码该构建物的核酸序列操作性地连接到合适的启动子序列，使得编码这种融合肽的核酸序列会在宿主细胞中被转录和/或翻译成所需的融合肽。优选的启动子是可用于在大肠杆菌中表达的启动子，如T7启动子。可以使用任何常用的表达系统，例如真核生物系统或原核生物系统。具体的实例包括酵母、毕赤酵母属、杆状病毒、哺乳动物和细菌系统，如大肠杆菌和柄杆菌属(Caulobacter)。
可将包含核酸序列的载体导入细胞中以表达肽活性治疗剂-ELP构建物。载体可以保持游离型，或者可整合到染色体中，只要它所携带的基因能被转录产生所需的RNA。载体可用标准的重组DNA技术方法来构建。载体可以是质粒、噬菌体、黏粒(cosmid)、噬菌粒(phagemid)、病毒，或者本领域公知的用以在原核细胞或真核细胞中进行复制和表达的任何其他类型载体。本领域技术人员会认识到，有多种本领域公知的成分可包括在这种载体中，它们包括多种转录信号，如启动子和其他能调节RNA聚合酶向启动子上的结合的序列。任何已知在要表达载体的细胞中有效的启动子，都可用来引发肽活性治疗剂-ELP构建物的表达。合适的启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。合适的启动子的实例包括SV40早期启动子区、包含在Rous肉瘤病毒的3'长末端重复序列中的启动子、HSV-1 (单纯疱疹病毒-1)胸苷激酶启动子、金属硫蛋白基因的调节序列等，以及以下能显示组织特异性和已被应用在转基因动物中的动物转录控制区:在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区；在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区；在睾丸、乳腺、淋巴样细胞和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区；在肝脏中有活性的清蛋白基因控制区；在肝脏中有活性的α-胎蛋白基因控制区；在肝脏中有活性的α 1-抗胰蛋白酶基因控制区；在类红细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区；在大脑的少突神经胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区。在一个实施方案中，对哺乳动物进行遗传修饰以在其乳汁中产生肽活性治疗剂-ELP构建物。进行这种遗传修饰的技术在2000年I月11日授权的美国专利6，013，857 (标题:“Transgenic Bovines and Milk from Transgenic Bovines (转基因牛和转基因牛产生的牛奶)”)中有描述。将转基因动物的基因组进行修饰以包含这样的转基因，它包含与乳腺启动子可操作地连接的编码肽活性治疗剂-ELP构建物的DNA序列。该DNA序列的表达导致在乳汁中产生肽活性治疗剂-ELP构建物。肽活性治疗剂-ELP构建物然后可通过相转变从获自转基因哺乳动物的乳汁中分离得到。转基因哺乳动物优选是牛。本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物可用相转变循环程序使之与其他污染性蛋白质分离开来而获得高纯度，操作方法是利用肽活性治疗剂-ELP构建物的温度依赖性溶解度，或者将盐加到含有该构建物的介质中。可使用连续的反相转变循环来获得高度纯度。除了温度和离子强度外，其他可用于调节肽活性治疗剂-ELP构建物的反转变的环境变量包括pH、无机和有机溶质和溶剂的加入、侧链离子化或化学修饰及压力。在本发明一个具体的示例性实施方案中，构建了 10聚五肽ELP (ELP10聚体)。该ELPlO聚体可进行寡聚化或多聚化达18倍，以产生出具有精确指定分子质量的一文库的(alibrary of) ELPs (10-、20-、30-、60-、90_、120-、150-和 180 聚体)。然后可将 ELP 聚合物或寡聚物融合到肽活性治疗剂的C末端或N末端，以形成肽活性治疗剂-ELP构建物。可将第二肽活性治疗剂融合到该融合蛋白构建物的ELP成分，产生出三元融合体。任选地，可使用一个或多个间隔序列来将ELP成分与肽活性治疗剂隔开。本发明 因此提供了这样的肽活性治疗剂-ELP构建物，其中的肽活性治疗剂可以是多种内源分子的任何一种的天然或合成形式，或者是非天然的肽物质，或者任何前述肽的功能等同物。
本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物克服了肽活性治疗剂当进行胃肠外给予时的主要缺陷，即这种肽容易被血浆蛋白酶代谢掉。肽活性治疗剂的口服给予途径更成问题，因为除了胃中的蛋白水解外，胃的高酸性还会在这种肽活性治疗剂到达它们预定的靶标组织之前就把它们破坏掉。通过胃和胰腺酶类的作用所产生的肽和肽片段，被肠刷状缘膜中的外肽酶和内肽酶切割产生二肽和三肽，即使能避免胰酶类的蛋白水解，多肽还会受到刷状缘肽酶的降解。任何能通过胃部又幸存下来的肽活性治疗剂在胃黏膜中又受到代谢作用，黏膜有穿透屏障阻止它们进入细胞。本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物克服了这种缺陷，提供了在生物利用度、生物不可利用度、治疗半寿期、降解抗性等方面具有增强的功效的组合物形式的肽活性治疗剂。本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物因此使得可以采用口服和胃肠外剂型以及各种其他的可使肽活性治疗剂以高效的方式得到利用的剂型。例如，这种构建物使得可以使用能实现高度黏膜吸收的剂型，同时还可以用较低的剂量产生最佳的疗效。ELP/肽活性治疗剂构建物还可包括间隔序列作为构建物的一个部分。间隔序列可以是任何合适的类型，可以是肽间隔序列，或者是非肽化学部分。肽间隔序列可以被蛋白酶切割，或者不被蛋白酶切割。举例说，可切割的肽间隔序列包括但不限于被各种类型的蛋白酶所识别的肽序列，所述蛋白酶例如凝血酶、因子Xa、纤溶酶(血液蛋白酶)、金属蛋白酶、组织蛋白酶(例如GFLG等)和在其他身体区室(corporeal compartment)中存在的蛋白酶。不可切割的间隔序列同样可以是任何合适的类型，包括例如式[(Gly)n-Ser]mK示的不可切割间隔序列部分，其中η为1-4，包括I和4 ;m为1-4,包括I和4。另外，非肽化学间隔序列也可以是任何合适的类型，包括例如在BioconjugateTechniques, Greg Τ.Hermanson,出版 Academic Press, Inc., 1995 中描述的功能接头(functional linker)和 Cross-Linking Reagents Technical Handbook,获自 PierceBiotechnology, Inc.(Rockford, Illinois)中指定的功能接头，两个参考文献通过引用结合到本文中。示例性的化学间隔序列包括能连接到Lys的胺基团的同双功能接头(homobifunctional linker)及能在一个末端连接Cys和在另一个末端连接Lys的异双功能接头(heterobifunctional linker),还有其他能将蛋白质与抗体的Fe区连接的双功能接头，其中抗体中的糖首先被氧化成二醇或醛。本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物可应用于预防或治疗病症(condition)或疾病状态(disease state)。虽然这种构建物在本文中是针对在动物受试者上有用的肽活性治疗剂进行描述的，但本发明还构思了对植物系统的病症或疾病状态的预防或治疗有用的肽活性治疗剂-ELP构建物。举例说，在植物上有用的肽活性治疗剂-ELP构建物的肽成分可具有杀昆虫、除草、杀真菌和/或杀害虫功效。本发明的又一个方面涉及这样的基因疗法，它采用本发明的融合基因治疗组合物和相关联的任何合适类型的载体，例如AAV、牛痘、痘病毒、HSV、反转录病毒、脂质转染、RNA转移等。
在治疗使用中，本发明构思了治疗已遭受或潜在易遭受这种病症或疾病状态且需要这种治疗的动物受试者的方法，所述方法包括将对所述病症或疾病状态有疗效的有效量的本发明肽活性治疗剂-ELP构建物给予该动物。
要用本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物治疗的动物受试者包括人和非人动物(例如鸟、狗、猫、牛、马)受试者，优选哺乳动物受试者，最优选人受试者。可将本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物以任何合适的治疗上有效和安全的剂量给予动物受试者，这视所要治疗的具体病症或疾病状态而定，这个剂量可由本领域技术人员根据本文的公开内容无需过多的实验就容易确定出。一般来说，为实现疗效肽活性治疗剂-ELP构建物中的肽活性治疗剂的合适剂量可例如为I微克(yg)至100毫克(mg)每公斤接受者体重每天，优选10微克(yg)至50毫克(mg)每公斤体重每天，最优选10微克(μ g)至50毫克(mg)每公斤接受者体重每天。所需的剂量可以作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个分剂量来给出，在一天中的适当间隔时间给予。这些分剂量可以以单位剂量形式给予，每个单位剂量形式例如含有10μ g-1000mg、优选50μ g-500mg、更优选50μ g-250mg活性成分。或者，如果接受者的病况需要的话，可以以连续输注的形式给予剂量。给予方式和剂型当然会影响到对特定治疗应用所要求的和有效的肽活性治疗剂
治疗量。
例如，对于同一肽活性治疗剂，口服给予的剂量可以是胃肠外给予方法所用的剂量水平的至少两倍，例如2-10倍。本发明的肽活性治疗剂-ELP构建物可以原样给予，也可以以其药物可接受酯、盐和其他生理上功能衍生物的形式给予。本发明还构思了包含本发明肽活性治疗剂-ELP构建物的兽医用和人医疗用药物制剂。在这种药物制剂中·，肽活性治疗剂-ELP构建物可以与它的一种或多种药物可接受载体和任选与任何其他的治疗成分一起使用。载体必须在与制剂的其他成分相容和不会对其接受者过度有害的意义上来说是药物可接受的。肽活性治疗剂-ELP构建物是以能有效实现如上所述的所需药理学作用的量和以适于实现达到所需的日剂量的数量来提供。肽活性治疗剂-ELP构建物的制剂既包括适于胃肠外给予的制剂，也包括适于非胃肠外给予的制剂，具体的给予方式包括口服、直肠内、口腔、局部、鼻内、眼内、皮下、肌肉内、静脉内、透皮、鞘内、关节内、动脉内、蛛网膜下、支气管内、淋巴、阴道和子宫内给予。优选适合口服给予和胃肠外给予的制剂。当肽活性治疗剂-ELP构建物在包括液体溶液的制剂中使用时，该制剂可方便地进行口服给予或胃肠外给予。当肽活性治疗剂-ELP构建物在液体混悬剂制剂中使用或者作为散剂在生物相容性载体制剂中使用时，该制剂可以方便地进行口服给予、直肠内给予或支气管内给予。当肽活性治疗剂-ELP构建物以粉末固体的形式直接使用时，活性剂可方便地进行口服给予。或者，它可进行支气管内给予，这是这样进行:将粉末在载气中雾化以形式粉末的气体分散体，患者从包括合适的喷雾装置的呼吸管路吸入该气体分散体。包含本发明肽活性治疗剂-ELP构建物的制剂可便利地以单位剂量形式呈现，且可通过药学领域公知的任何方法来制备。这种方法通常包括将肽活性治疗剂-ELP构建物与构成一种或多种辅助成分的载体结合在一起的步骤。通常，制剂是这样制备的:将肽活性治疗剂-ELP构建物与液体载体、微细固体载体或这两种载体均匀地和紧密地结合在一起，然后如有需要，将产品成形为所需制剂的剂型。适合口服给予的本发明制剂可作为不连续单元(discrete unit)呈现，如胶囊剂、扁囊剂(cachet)、片剂或锭剂，每个不连续单元含有预定量的粉末或颗粒形式的活性成分；或者作为在含水液体或非水液体中的混悬剂呈现，如糖浆剂、酏剂、乳剂或饮剂(draught)片剂可通过压制或模制来制备，任选加有一种或多种辅助成分。压制片剂可通过在合适的机器中进行压制来制备，其中肽活性治疗剂-ELP构建物为自由流动形式，如粉末或颗粒，任选与粘合剂、崩解剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或脱模剂(dischargingagent)混合。包含粉末状肽活性治疗剂-ELP构建物和合适载体的混合物的模制片剂，可通过在合适的机器中进行模制来制备。糖浆剂可通过将肽活性治疗剂-ELP构建物加到糖(例如蔗糖)的浓缩水溶液中来制备，在该水溶液中还可加入任何辅助成分。这种辅助成分可包括矫味剂、合适的防腐齐U、防止糖结晶的物质和增加任何其他成分的溶解度的物质如多元醇(例如甘油或山梨糖醇)。适合胃肠外给予的制剂便利地包含肽活性治疗剂-ELP构建物的无菌含水制品(preparation),该制品优选与接受者的血液等渗(例如生理盐水溶液)。这种制剂可包含悬浮剂和增稠剂或者其他设计来将肽活性治疗剂靶向血液成分或者一个或多个器官的微颗粒系统。这些制剂可以以单位剂量形式或多剂量形式呈现。鼻腔喷雾剂包含纯化的肽活性治疗剂-ELP构建物水溶液与防腐剂和等渗剂。优选将这种制剂调节到与鼻腔黏膜相容的pH和等渗状态。供直肠内给予的制剂可作为与合适载体如可可脂、氢化脂肪或氢化脂肪羧酸所成的栓剂呈现。眼用制剂的制备 方法类似于鼻腔喷雾剂，例外的是优选对pH和等渗因素加以调整以与眼睛相匹配。局部用制剂包含溶于或悬浮于一种或多种介质，如矿物油、石油、多元醇或其他用于局部用药物制剂的基料的肽活性治疗剂-ELP构建物。除了上述成分外，本发明的制剂还可包含一种或多种选自以下的辅助成分:稀释齐 、缓冲剂、矫味剂、崩解剂、表面活性剂、增稠剂、润滑剂、防腐剂(包括抗氧化剂)等。以下非限制性实施例更加充分地说明本发明的特征和优点。实施例以下示例性地给出一些涉及到融合蛋白的实验对本发明的特征作更加充分的说明，这些融合蛋白含有与各种不同的ELP序列融合的各种不同的重组蛋白质，如硫氧还蛋白、淀粉酶抑肽、胰岛素、Τ20蛋白、干扰素、烟草蚀纹病毒蛋白酶、小异型二聚体伴侣孤儿受体、雄激素受体配体结合结构域、糖皮质类固醇受体配体结合结构域、雌激素受体配体结合结构域、G蛋白、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶肽、血管生长抑素(Κ1-3)、蓝色荧光蛋白(BFP)、钙调蛋白(CalM)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、白细胞介素I受体拮抗剂(IL-1Ra)、萤光素酶、组织转谷氨酰胺酶(tTg)、吗啡调节神经肽(MMN)、神经肽Y(NPY)、食欲肽-B、瘦蛋白、ACTH、降钙素、肾上腺髓质素(AM)、甲状旁腺激素(PTH)、防御素和生长激素。实施例1:
蛋白质和长肽的产生和纯化在所给出的案例研究中，使含有ELP-(TEV)-肽/蛋白质构建物的大肠杆菌菌株BL21star (Invitrogen)在补加有抗生素的培养基中37°C生长24小时，不作诱导。收获培养物，重悬在50mM Tris-HCL pH8.0和ImM EDTA中。细胞通过在冰上超声破碎进行裂解。细胞碎片通过在20，OOOg下4°C离心30分钟进行去除。通过在25°C下向裂解物中加入NaCl至最终浓度1.5M，然后在25°C下20，OOOg离心15分钟，诱导反温度转变。所得的沉淀含有ELP-(TEV)-肽/蛋白质融合体和非特异性NaCl沉淀蛋白质。将沉淀重悬于40ml用冰预冷的缓冲液中，20，000g，4°C下离心15分钟，以除去非特异性的不溶性蛋白质。将温度转变循环再反复进行三次，以提高ELP-TEV融合蛋白的纯度和将最终体积减少到小于5ml。肽/蛋白质与ELP的分离是通过加入ELP-TEV蛋白酶并在25°C下温育18小时来实现。在0.5M NaCl存在下用最终温度转变，然后在室温下10，OOOg离心，以进一步将被切割的肽/蛋白质从ELP和ELP-TEV蛋白酶纯化出来。经NaCl转变的ELP、ELP-TEV蛋白酶和不被切割的ELP-肽/蛋白质存在于不可溶部分，而肽/蛋白质则保留在可溶部分中。进行HPLC和液相色谱质谱(LC-MS)分析，以检验TEV切割的ELP- (TEV)-肽/蛋白质的准确性和肽/蛋白质的最终纯度。用通过ExPASy tools ProtParam计算得到的消光系数,分光光度法测定ELP-(TEV)-肽/蛋白质、ELP和纯化的肽/蛋白质的浓度。(19th AnnualAmericanPeptide Symposium, 2005 年 6 月；展板展示)。37氨基酸肽的产生用以上(deltaPhase )系统表达和纯化37氨基酸肽。表达的ELP-肽融合体通过几轮转变来纯化。纯化的融合体与TEV蛋白酶温育以将肽切割。在单独的实验中将TEV蛋白酶制备成ELP融合体，这使得TEV蛋白酶在温育后随同被切割的ELP —起从溶液中分离出来。结果在图1中显示，其中M是分子量标记，S是超声处理后的裂解物，P是离心所得的沉淀(转变前)，L是可溶性裂解物，Tn是第η次转变所得的沉淀。图2显示分子量和纯度的LC-MS验证结果，由图可见所得的肽纯度大于90%，同时有微量的脱酰胺所产生的杂质。一系列肽变体的快速产生然后测定对于一系列的肽可能实现的通量和纯度。表I所示的结果证明在一系列的肽中能够产生一致的结果。之前，化学合成的局限使肽的产生限制在每3-6星期产生一个肽，这限制了进行肽优化的速度。使用如上所述的deltaPhase 系统，可在不到两星期时间里产生出以下六个肽。由于这个系统能够进行平行运行，其实本应能够容易地使通量在几个星期内增加到数百个。表1:一系列肽 变体的产率和纯度。
权利要求
1.一种融合蛋白(FP)治疗组合物，所述FP治疗组合物包含与至少一个肽活性治疗剂偶联的至少一个弹性蛋白样肽(ELP)。
2.权利要求1的FP治疗组合物，其中所述ELP与肽活性治疗剂在其N末端或C末端共价键合。
3.权利要求1的FP治疗组合物，所述FP治疗组合物包含至少两个肽活性治疗剂，其中一个肽活性治疗剂在N末端与ELP共价键合，另一个肽活性治疗剂在C末端与ELP共价键
4.权利要求1的FP治疗组合物，其中所述肽活性治疗剂相对于相应的不与ELP偶联的肽活性治疗剂来说其特征在于增强的体内功效。
5.权利要求4的FP治疗组合物，其中所述增强的体内功效包括选自以下的增强的特征:溶解性、生物利用度、生物不可利用度、有效治疗剂量、制剂相容性、蛋白水解抗性、给予的肽活性治疗剂的半寿期、给予后在身体内的持续性和给予后从身体的清除率。
6.权利要求1的FP治疗组合物，所述治疗组合物还包括在ELP和肽活性治疗剂之间的间隔序列部分。
7.权利要求6的FP治疗组合物，其中所述间隔序列部分选自:控制组合物的药代动力学的部分、蛋白酶不敏感性部分、非肽化学部分、凝血酶、Xa因子、血液蛋白酶、金属蛋白酶、组织蛋白酶、可连接到Lys的胺基团的同型双功能接头；可在一个末端与Cys连接、在另一个末端与Lys连接的异型双功能接头；和可将蛋白质连接到抗体的Fe区的双功能接头。
8.权利要求6的FP治疗组合物，其中所述间隔序列部分包含选自具有式[(Gly)n-Ser]m的非可切割间隔序列部分的部分，其中η为1-4，包括I和4 ;m为1_4，包括I和4。
9.权利要求1的FP治疗组合物，其中所述ELP包括重复肽序列，其中所述重复肽序列选自聚四肽、聚五肽、聚六肽、聚七肽、聚八肽和聚九肽。
10.权利要求1的FP治疗组合物，其中所述ELP包括多聚或寡聚重复单元，其中所述重复单元选自 SEQ ID NO:USEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:ll 和 SEQID NO:12o
11.权利要求1的FP治疗组合物，其中所述肽活性治疗剂包括选自以下的蛋白质:胰岛素A肽、T20肽、干扰素α 2Β肽、烟草蚀纹病毒蛋白酶、小异型二聚体伴侣孤儿受体、雄激素受体配体结合结构域、糖皮质类固醇受体配体结合结构域、雌激素受体配体结合结构域、G蛋白a Q、l-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶肽、G蛋白α S、血管生长抑素、蓝色荧光蛋白、钙调蛋白、氯霉素乙酰转移酶、绿色荧光蛋白、白细胞介素I受体拮抗剂、萤光素酶、组织转谷氨酰胺酶、吗啡调节神经肽、神经肽Y、食欲肽-B、瘦蛋白、ACTH、降钙素、肾上腺髓质素、甲状旁腺激素、防御素和生长激素。
12.权利要求1的FP治疗组合物，其中所述ELP包含五肽Ile-Pro-Gly-X-Gly或Leu-Pro-Gly-X-Gly的寡聚重复单元，其中X为任何天然或非天然氨基酸残基，且其中X任选在各多聚或寡聚重复单元之间有变化。
13.权利要求12的融合蛋白，其中所述多聚或寡聚重复单元的X成分包含一个或多个选自以下的氨基酸残基:丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸残基。
14.一种融合基因治疗组合物，所述融合基因治疗组合物包括编码包含与至少一个弹性蛋白样肽(ELP)偶联的至少一个肽活性治疗剂的融合蛋白的核苷酸序列。
15.权利要求14的融合基因治疗组合物，其中所述核苷酸序列可操作地连接到表达控制兀件。
16.权利要求15的融合基因治疗组合物，其中所述表达控制元件包含启动子。
17.一种增强肽活性治疗剂的体内功效的方法，所述方法包括将所述肽活性治疗剂与至少一个弹性蛋白样肽(ELP)偶联以形成融合肽治疗组合物，其中所述肽活性治疗剂相对于相应的不与ELP偶联的肽活性治疗剂来说其特征在于增强的体内功效。
18.权利要求17的方法，其中所述增强的体内功效是所述肽活性治疗剂对抗蛋白水解降解的稳定化作用。
19.权利要求17的方法，其中所述增强的体内功效是所述肽活性治疗剂的提高的生物利用度。
20.一种治疗需要肽活性治疗剂的受试者的方法，所述方法包括给予所述患者包括以下的治疗组合物:(i)所述与至少一个ELP偶联的肽活性治疗剂，或者(ii)编码包含所述肽活性治疗剂和至少一个ELP的融合蛋白的、可操作地连接到其表达控制元件的核苷酸序列。
21.一种治疗剂剂型，其中所述治疗剂与ELP缀合。
22.权利要求20的治 疗剂剂型，所述剂型适于口服或胃肠外给予。
全文摘要
本发明涉及融合肽治疗组合物。具体地，本发明提供含有包含弹性蛋白样肽(ELPs)和肽活性治疗剂的融合蛋白(FPs)的治疗组合物，及制备和使用这种组合物和融合蛋白的方法。这类治疗组合物与单独的肽活性治疗剂相比，使得肽活性治疗剂的改进功效得以实现。与相应的含有相同肽活性治疗剂但不含相关ELPs的组合物相比，本发明治疗组合物中的肽活性治疗剂的增强的功效可包括改进的溶解性、生物利用度、生物不可利用度和半寿期等。
文档编号C07K14/78GK103230598SQ201310127490
公开日2013年8月7日 申请日期2007年9月6日 优先权日2006年9月6日
发明者A.基尔科蒂 申请人:费斯生物制药公司