密码子使用、内含肽或其突变体和纯化策略，针对这些 系统的任一个并针对胞内或胞外生产优化表达。技术人员应了解，本发明不限于任何特定 的靶肽或作为来源的任何物种。
[0064]本发明的实施方案 本发明的非限制性实施方案为： 1. 一种用于生产肽的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤，其 中所述融合蛋白包含靶肽和内含肽，其中所述内含肽的大小被减到最小，并且通过与ifre GyrA内含肽（SEQIDNO: 1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
[0065] 2.实施方案1的方法，其中所述内含肽是GyrA内含肽。
[0066] 3.前述实施方案中任一个的方法，其中所述内含肽是ifreGyrA内含肽。
[0067] 4.前述实施方案中任一个的方法，其中所述内含肽是通过切除ifreGyrA内含肽 (SEQIDNO: 1)的残基107-164或残基107-164的一部分大小被减到最小的ifreGyrA内含 肽。
[0068] 5.前述实施方案中任一个的方法，其中所述内含肽是通过切除ifreGyrA内含肽 (SEQIDNO: 1)的残基107-164或残基107-164的一部分大小被减到最小且其中所切除的 残基被包含1-10个氨基酸的接头置换的ifreGyrA内含肽。
[0069] 6.前述实施方案中任一个的方法，其中所述内含肽是通过切除ifreGyrA内含肽 (SEQIDNO: 1)的残基107-164或残基107-164的一部分大小被减到最小且其中所切除的 残基被包含6-10个氨基酸的接头置换的ifreGyrA内含肽，其中至少6个接头的氨基酸是 甘氨酸和/或丝氨酸。
[0070] 7.前述实施方案中任一个的方法，其中所述内含肽是通过切除ifreGyrA内含肽 (SEQIDN0:1)的残基107-164大小被减到最小且其中所切除的残基被序列GSGSGSGS的接 头置换的ifreGyrA内含肽。
[0071] 8.前述实施方案中任一个的方法，其中所述内含肽的序列是SEQIDN0:20。
[0072] 9.前述实施方案中任一个的方法，其中所述内含肽序列位于靶肽的羧基端。
[0073] 10.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是参与糖尿病或肥胖症控制的 肽激素。
[0074] 11.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是参与糖尿病控制的肽激素。
[0075] 12.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是参与肥胖症控制的肽激素。
[0076] 13.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是α-酰胺化肽。
[0077] 14.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽的内源形式是α-酰胺化肽。
[0078] 15.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是羧基端生物缀合的肽。
[0079] 16.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽选自ΡΥΥ、ΡΡ、a-CGRP、CT和胰 岛淀粉样多肽或其类似物。
[0080] 17.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽选自PYY、PP、α-CGRP和胰岛 淀粉样多肽或其类似物。
[0081] 18.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是PYY或其类似物。
[0082] 19.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是APYY或其类似物。
[0083] 20.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是[Gly4]-PYY(4_36)。
[0084] 21.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是[Gly4]-APYY(4_36)。
[0085] 22.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是PYY(3-36)。
[0086] 23.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是APYY(3-36)。
[0087] 24.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是[Arg4,Glnl8， Lys30]-PYY(3-36)。
[0088] 25.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是[Arg4,Glnl8， Lys30]-APYY(3-36)。
[0089] 26.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是a-CGRP或其类似物。
[0090] 27.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是a-CGRP。
[0091] 28.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是Aa-CGRP。
[0092] 29.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是CT或其类似物。
[0093] 30.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是CT。
[0094] 31.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是ACT。
[0095] 32.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是PP或其类似物。
[0096] 33.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是PP。
[0097] 34.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是APP。
[0098] 35.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是胰岛淀粉样多肽或其类似 物。
[0099] 36.前述实施方案中任一个的方法，其中所述靶肽是人胰岛淀粉样多肽或其类似 物。
[0100] 37.前述实施方案中任一个的方法，其中所述革巴肽是[Aspl4,Argl7,Pro21， Pr027,Arg35]_胰岛淀粉样多肽。
[0101] 38.前述实施方案中任一个的方法，其中所述革巴肽是[Aspl4,Argl7,Pro21， Pr027,Arg35]_人胰岛淀粉样多肽。
[0102] 39.前述实施方案中任一个的方法，其中所述融合蛋白另外包含允许通过亲和色 谱方法或其它色谱方法鉴定和/或纯化的纯化标签和任选蛋白酶位点。
[0103] 40.实施方案39的方法，其中所述纯化标签是碱性的。
[0104] 41.实施方案39的方法，其中所述纯化标签包括组氨酸标签。
[0105] 42.实施方案39-41中任一个的方法，其中所述纯化标签和任选蛋白酶位点位于 靶肽的氨基端。
[0106] 43.实施方案39-42中任一个的方法，其中所述纯化标签可用合适的蛋白酶切割 除去以得到所述靶肽。
[0107] 44.前述实施方案中任一个的方法，其中所述融合蛋白在细菌、酵母、哺乳动物细 胞或在转基因哺乳动物的体液中表达。
[0108] 45.前述实施方案中任一个的方法，其中所述融合蛋白在细菌或酵母中表达。
[0109] 46.前述实施方案中任一个的方法，其中所述融合蛋白在细菌中表达。
[0110] 47.前述实施方案中任一个的方法，其中所述融合蛋白在大肠杆菌中表达。
[0111] 48.前述实施方案中任一个的方法，所述方法还包括硫醇基诱导切割融合蛋白， 产生靶肽的α-硫酯。
[0112] 49.实施方案48的方法，所述方法还包括α-硫酯转化为靶肽相应的α-酰胺。
[0113] 50.实施方案49的方法，其中所述酰胺化步骤在铵亲核体存在下发生。
[0114] 51.实施方案50的方法，其中所述铵亲核体是碳酸氢铵。
[0115] 52. -种用于生产α_酰胺化肽的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部 分表达的步骤，其中所述融合蛋白包含靶肽和SEQIDΝ0: 20的内含肽。
[0116] 53.实施方案52的方法，其中所述内含肽序列位于靶肽的羧基端。
[0117] 54.实施方案52-53中任一个的方法，其中所述融合蛋白还包含允许通过亲和色 谱方法或其它色谱方法鉴定和/或纯化的纯化标签和任选蛋白酶位点。
[0118] 55.实施方案54的方法，其中所述纯化标签包括组氨酸标签。
[0119] 56.实施方案55的方法，其中所述纯化标签包括碱性标签。
[0120] 57.实施方案54-56中任一个的方法，其中所述纯化标签和任选蛋白酶位点位于 所述靶肽的氨基端。
[0121] 58.实施方案54-57中任一个的方法，其中所述纯化标签可用合适的蛋白酶切割 除去以得到所述靶肽。
[0122] 59.实施方案52-58中任一个的方法，其中所述融合蛋白在细菌、酵母、哺乳动物 细胞或在转基因哺乳动物的体液中表达。
[0123] 60.实施方案59的方法，其中所述融合蛋白在细菌或酵母中表达。
[0124] 61.实施方案59的方法，其中所述融合蛋白在细菌中表达。
[0125] 62.实施方案59的方法，其中所述融合蛋白在大肠杆菌中表达。
[0126] 63. -种用于生产[Gly4]-APYY(4_36)的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白 的一部分表达的步骤，其中所述融合蛋白包含SEQIDN0: 10的靶肽、SEQIDN0: 20的内 含肽、SEQIDNO: 4的纯化标签和SEQIDNO: 8的蛋白酶位点，且其中所述内含肽序列位 于靶肽的羧基端，所述纯化标签和蛋白酶位点位于靶肽的氨基端。
[0127] 64. -种用于生产APYY(3-36)的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部 分表达的步骤，其中所述融合蛋白包含SEQIDN0: 11的靶肽、SEQIDN0: 20的内含肽、 SEQIDN0: 5的纯化标签和SEQIDN0: 9的蛋白酶位点，且其中所述内含肽序列位于所述 靶肽的羧基端，所述纯化标签和蛋白酶位点位于所述靶肽的氨基端。
[0128] 65. -种用于生产Aa-CGRP的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分 表达的步骤，其中所述融合蛋白包含SEQIDΝ0: 12的靶肽、SEQIDΝ0: 20的内含肽、SEQ IDN0: 5的纯化标签和SEQIDN0: 9的蛋白酶位点，且其中所述内含肽序列位于所述靶肽 的羧基端，所述纯化标签和蛋白酶位点位于所述靶肽的氨基端。
[0129] 66. -种用于生产APP的方法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的 步骤，其中所述融合蛋白包含SEQIDN0: 14的靶肽、SEQIDN0: 20的内含肽、SEQIDN0: 5的纯化标签和SEQIDNO: 9的蛋白酶位点，且其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基 端，所述纯化标签和蛋白酶位点位于所述靶肽的氨基端。
[0130] 67. -种用于生产[Arg4，Glnl8，Lys30]-APYY(3-36)的方法，所述方法包括将肽 作为融合蛋白的一部分表达的步骤，其中所述融合蛋白包含SEQIDN0: 15的靶肽、SEQID NO: 20的内含肽和SEQIDNO: 6的纯化标签，且其中所述内含肽序列位于所述靶肽的羧基 端，所述纯化标签位于所述靶肽的氨基端。
[0131] 68. -种用于产[Aspl4，Argl7，Pro21，Pro27，Arg35]-人胰岛淀粉样多肽生的方 法，所述方法包括将肽作为融合蛋白的一部分表达的步骤，其中所述融合蛋白包含SEQID NO: 16的靶肽、SEQIDNO: 20的内含肽和SEQIDNO: 7的纯化标签，且其中所述内含肽 序列位于所述靶肽的羧基端，所述纯化标签位于所述靶肽的氨基端。
[0132] 69. -种包含靶肽和内含肽的融合蛋白，其中所述内含肽的大小被减到最小，并 且通过与ifreGyrA内含肽（SEQIDN0:1)的3位对齐在相应位置上携带半胱氨酸突变。
[0133] 70.实施方案69的融合蛋白，其中所述内含肽是GyrA内含肽。
[0134] 71.实施方案70的融合蛋白，其中所述内含肽是ifreGyrA内含肽。
[0135] 72.实施方案71的融合蛋白，其中所述内含肽是通过切除ifreGyrA内含肽（SEQ IDNO: 1)的残基107-164或残基107-164的一部分大小被减到最小且其中所切除的残基被 序列GSGSGSGS的接头置换的ifreGyrA内含肽。
[0136] 73.实施方案72的融合蛋白，其中所述内含肽是通过切除ifreGyrA内含肽（SEQ IDNO: 1)的残基107-160大小被减到最小且其中所切除的残基被序列GSGSGSGS的接头置 换的ifreGyrA内含肽。
[0137] 74.实施方案73的融合蛋白，其中所述内含肽的序列是SEQIDN0: 20。
[0138] 75.实施方案69-74中任一个的融合蛋白，其中所述内含肽序列位于所述靶肽的 羧基端。
[0139] 76.实施方案69-75中任一个的融合蛋白，其中所述靶肽是参与糖尿病或肥胖症 控制的肽激素。
[0140] 77.实施方案69-76中任一个的融合蛋白，其中所述靶肽是参与糖尿病控制的肽 激素。
[0141] 78.实施方案69-76中任一个的融合蛋白，其中所述靶肽是参与肥胖症控制的肽 激素。
[0142] 79.实施方案69-78中任一个的融合蛋白，其中所述靶肽是α-酰胺化肽。
[0143] 80.实施方案69-78中任一个的融合蛋白，其中所述靶肽的内源形式是α-酰胺 化肽。
[0144] 81.实施方案69-78中任一个的融合蛋白，其中所述靶肽是羧基端生物缀合的 肽。
[0145] 82.实施方案69-78中任一个的融合蛋白，其中所述靶肽选自ΡΥΥ、ΡΡ、a-CGRP和 胰岛淀粉样多肽或其类似物。
[0146] 83.实施方案82的融合蛋白，其中所述靶肽是ΡΥΥ或其类似物。
[0147] 84.实施方案83的融合蛋白，其中所述靶肽是ΑΡΥΥ或其类似物。
[0148] 85.实施方案83的融合蛋白，其中所述靶肽是[Gly4]-PYY(4_36)。
[0149] 86.实施方案83的融合蛋白，其中所述靶肽是[Gly4]-AP