C含有具有T3C突变的最小化ifreGyrA内含肽变体。最小化的内含肽在氨基端和羧基端 剪接区之间的46-57个氨基酸被除去或被小的接头取代（表2)。更具体地说，被除去的区 域包含ifreGyrA内含肽的残基103-164的一部分，其按照晶体结构（KlabundeT. (1998) 5，31-36)位于駿基端剪接区的β链（strand)9和10之间。 经检查的接头包括连接ifreGyrA内含肽的Λ端剪接结构域β链4和5的LDRHGN序列、来 自接头数据库的α-螺旋ADNLALA接头序列(GeorgeRA.和HeringaJ. (2002) Engineering,15, 871-879)、连接黑腹果绳的hedgehog蛋 白质的β链9和10的RDVETGE接头（如Hiraga, Κ·等（2005)^Mol.Biol.354, 916-926所述）和柔件GSGSGSGS接头。
[0197] 表2.具有各自的缺失大小、接头和突变的内含肽变体的列表。
[0198]融合蛋白的硫醉基诱导的切壽1丨： 如通用方法中所述，使融合蛋白1A至1Q在含有200mLLB培养基的摇瓶中表达。不 溶性蛋白质用MQ洗涤两次，分成较小的部分并储存在-20°C下。将不溶性蛋白质沉淀在增 溶缓冲液[100mM磷酸钠，pH7. 5,5Μ脲]中重新悬浮，在冰上孵育1小时后过滤（0.45 μm)。蛋白质浓度通过RP-UPLC方法Α测定，接着用增溶缓冲液稀释成0. 6mg/ml的终浓 度。通过在485yL含水稀缓冲液A[100mM磷酸钠，pH7. 5,250mMNaCl]和190yL缓 冲液B[100mM磷酸钠pH7. 5,2M脲，150mMNaCl]的混合物中稀释，产生在100mM磷酸 钠pH7. 5,2Μ脲，150mMNaCl中0.2mg/ml蛋白质的终浓度，使等分的蛋白质溶液（325 μL)重新折叠。通过用缓冲液B中的2Μ原液将MESNa加至100mM而诱导切割。让反应 在5°C下在Eppendorf管中伴随着搅拌（300rpm)过夜进行。随时间推移收集等量样品，用 1体积的含1. 7%HC1的6Μ盐酸胍猝灭至约pH3,并通过RP-UPLC方法B分析，通过LC-MS 方法A表征。进行一式三份的测定，产物形成计算为面积α 面积α 面积$e 质），其中α-硫酯产物为氨基端带标签的[Gly4]-PYY(4-36)α-硫酯，蛋白质为融合蛋白。 将产物形成作图为时间函数。使用极大摩尔过量的MESNa达到准一级反应，速率常数 通过将数据拟合至方程式尸=尺(1 -e_々i)来测定，其中P是在时间ifl寸形成的肽α-硫 酯产物的百分比，忍是所获得的肽α-硫酯产物的最大百分比，々是使用GraphPadPrism5· 01(GraphPadSoftwareInc.，LaJolla，CA)的观察速率。
[0199] 1. 1.测量的功能性最小化的内含肽的活性: 最初，GyrA内含肽就其大小而言被优化。截短的内含肽变体在ifreGyrA内含肽序 列的Alal03和Alal64之间除去最少46个残基（相当于整个内含肽大小的23%)。与蛋白 质1A相比，蛋白质1E中除去内含肽的残基112-157 (46个氨基酸）（SEQIDN0: 21)略 微降低剪接活性，而蛋白质IF中除去内含肽的残基107-160 (54个氨基酸）（SEQIDNO: 22)导致无活性的内含肽（表3)。蛋白质1E和IF的差异是蛋白质1E的内含肽具有一些非 结构化的氨基酸保留在β链9和10之间，而β链9和10之间的整个非结构化区域在蛋 白质1F中被除去。蛋白质1F的内含肽残基Glnl06和Phel61之间引入柔性GSGSGSGS接 头，导致蛋白质1B含有具有SEQIDN0: 19的工程改造的内含肽序列，导致重新获得与蛋 白质1A的天然内含肽相当的水平的活性（表3)。为了检查蛋白质1B中的内含肽是否可被 甚至进一步最小化，系统地除去在GSGSGSGS接头任一端的残基，产生6种融合蛋白1N-1S。 在蛋白质1L、1M和1N中，分别从内含肽的GSGSGSGS接头的氨基端除去1、2和3个氨基酸 (SEQIDN0: 28-30)，这引起内含肽活性显著降低，其中蛋白质1N未观察到切割（表3)。 相比之下，与蛋白质1B相比，分别在蛋白质10、1P和1Q(其中从内含肽的GSGSGSGS接头 的羧基端除去1-3个氨基酸）中观察到内含肽（SEQIDN0: 31-33)活性适度的1.1、1. 2 和1.7倍下降。
[0200] 为了评价接头区的结构完整性和电荷的差异的作用，将多个其它接头插入缺失位 点之间。在蛋白质1G和1H中，将LDRHGN接头分别插入内含肽的Aspl58和Ser111(SEQ IDNO: 23)或Glnl06和Phe161(SEQIDNO: 24)之间。与其中不存在接头的蛋白质1E 和IF的相应内含肽相比，蛋白质1G和1H的LDRHGN接头不改变内含肽活性（表3)。当 hedgehogRDVETGE接头（SEQIDN0: 25 中）、α-螺旋ADNLALA接头（SEQIDN0: 26 中） 或碱性GRGSGRGS接头（SEQIDNO: 27中）代替蛋白质1B的GSGSGSGS接头被引入时，分 别产生蛋白质II、1J和1K，内含肽活性降低达适度的1.8、4. 8和1.5倍（表3)。
[0201] 最大活性的最小化的内含肽是蛋白质1B中的一种，其中残基107-160被GSGSGSGS 接头取代（SEQIDNO: 19)。
[0202] 1.2.将T3C突变引入最小化的内含肽中： 接下来，将T3C突变引入蛋白质1B的最小化的内含肽中，产生蛋白质1C，其含有[Cys3,l06(GS)4161]-#x￡?GyrA(SEQIDNO: 20)。蛋白质ID中全长T3C内含肽变体、 [Cys3]-ifreGyrA(SEQIDNO: 18)被用作对照。与蛋白质1A的天然内含肽相比，蛋白质 1D和1C的T3C突变分别导致内含肽活性降低（表3)。与蛋白质1D中的全长内含肽相比， 蛋白质1C中最小化的内含肽活性的降低更显著。
[0203] 鉴定出了大小被减小约25%的几个有活性的ifreGyrA内含肽变体。这些最小化的 内含肽在Glnl06和Phel61之间的46-57个氨基酸被除去或用接头取代。有最大活性的最 小化的内含肽是具有引入的柔性GSGSGSGS接头而不是残基107-160的[106 (GS) 4161]-ifre GyrA(SEQIDN0: 19)。具有T3C突变的相应内含肽[Cys3，106(GS)4161]-ifreGyrA(SEQ IDNO: 20)也是有活性的，但是产生较慢的硫醇基诱导的切割。
[0204] 表3.融合蛋白及其相应的内含肽变体的分子量列表。还列举了硫醇基诱导的切 割的反应速率。
[0205] 实施例2.伸用工稈改诰的内含肽的蛋白质表汰水平 目标是测定工程改造的内含肽[Cys3，106(GS)4161]-ifreGyrA(SEQIDN0: 20)如何 影响含有所需靶肽的融合蛋白的表达水平。
[0206] 对于每个靶肽，[Gly4]-APYY(4_36)(SEQIDN0: 10)、APYY(3-36)(SEQIDN0: 11)、Aa-CGRP(SEQIDNO: 12)、ACT(SEQIDNO: 13)、APP(SEQIDNO: 14)、[Arg4， Glnl8，Lys30]-APYY(3-36)(SEQIDN0: 15)和[△8口14，厶坪17，？『021，卩『027，厶找35]-人胰 岛淀粉样多肽（SEQIDNO: 16)，构建了 3种不同的融合蛋白。所有融合蛋白都包含氨基端 延伸、革巴肽和ifreGyrA内含肽变体。每一个革巴肽的A、B和C融合蛋白分别含有天然ifreGyrA (SEQIDNO: 17)、[106(GS)4161]-ifreGyrA(SEQIDNO: 19)和[Cys3，106(GS)4161]-ifre GyrA(SEQIDNO: 20)内含肽。
[0207] 融合蛋白的表汰： 使用TPP细胞悬浮管，使含有合适质粒的BL21 (DE3)细胞在LB培养基（100μg/mL氨 苄西林）中在37°C下生长至约0. 4的0D_。使细胞培养物冷却至18°C维持20-30分钟，通 过在0. 4-0. 6的0D6。。时加入0. 5mMIPTG，诱导融合蛋白的表达。使蛋白质表达在18°C下 过夜。通过离心以1mL等量收获细胞。如通用方法所述进行SDS-PAGE分析。从诱导的裂 解物样品的条带强度估算水解和表达水平百分比（表4)。具体地说，水解计算为面积 (面积ses +面积?#*)，相对表达水平表示各组中融合蛋白A和B的面积相对于融合蛋白C的面积。根据可溶性和不溶性部分估算溶解度百分比，并计算为面积面积 +面积_4$_ )，其中面积和面积_4$_分别表示可溶性和不溶性样品中内含 肽和融合蛋白的总面积。
[0208] 2. 1.PYY-内含肽融合蛋白的表达 包含蛋白质1A、1B和1C的蛋白质1家族包括在氨基端延伸（通过HRV14-3C蛋白酶 位点（SEQIDN0: 8)含有碱性标签（SEQIDN0: 4))和羧基端ifreGyrA内含肽变体之间 融合的[Gly4]-APYY(4-36)，所述ifreGyrA内含肽变体分别为天然ifreGyrA(SEQIDN0: 17)、[106(GS)4161]-ifre(SEQIDN0:19)和[Cys3，106(GS)4161]-ifreGyrA(SEQIDN0: 20)。蛋白质1A-1C主要在可溶性部分中获得（表4)。约50%的蛋白质1A和蛋白质IB被 水解，而对于蛋白质1C的工程改造的内含肽而言未观察到水解。与蛋白质1A和1B相比， 对于蛋白质1C而言，没有水解与表达水平提高约30%有关。
[0209] 包含2A、2B和2C的蛋白质2家族包括在氨基端延伸（通过肠激酶蛋白酶位点 (SEQIDN0: 9)含有His标签（SEQIDN0: 5))和羧基端ifreGyrA内含肽变体之间融合 的APYY(3-36)，所述ifreGyrA内含肽变体分别为天然ifreGyrA、[106(GS)4161]-ifreGyrA 和[Cys3，106(GS)4161]-ifreGyrA。蛋白质2A-2C主要在可溶性部分中获得（表4)。分别 约60%和50%蛋白质2A和2B被水解，而对于蛋白质2C而言未观察到水解。这和与2A和 2B相比蛋白质2C的表达水平提高30-40%有关。
[0210] 包含6A、6B和6C的蛋白质6家族包括分别在可通过DAP1除去的氨基端富含组氨 酸的十二肽延伸（SEQIDN0: 6)和羧基端ifreGyrA、[106(GS)4161]-ifreGyrA和[Cys3， 106(GS)4161]-ifreGyrA之间融合的[Arg4,Glnl8,Lys30]-APYY(3-36)。所有 3 种融合蛋 白主要在可溶性部分中获得（表4)。约50%的蛋白质6A和6B被水解，而对于蛋白质6C而 言未观察到水解。这与相对于6C，蛋白质6A和6B的表达水平降低15-30%进一步有关。
[0211] 2. 2.α-CGRP-内含肽融合蛋白的表达 包含3A、3B和3C的蛋白质3家族包括在氨基端延伸（含有His标签（SEQIDN0: 5)和 肠激酶蛋白酶位点（SEQIDNO: 9))和羧基端ifreGyrA内含肽变体之间融合的Aa-CGRP， 所述ifreGyrA内含肽变体分别是天然ifreGyrA、[106(GS)4161]-ifreGyrA和[Cys3， 106(GS)4161]-ifreGyrA。所有3种融合蛋白主要在可溶性部分中获得（表4)。约50%的 蛋白质3A和3B被水解，而对于蛋白质3C而言未观察到水解。这与相对于3C，蛋白质3A和 3B的表达水平降低约30%进一步有关。
[0212] 2. 3.CT-内含肽融合蛋白的表达 包含4A、4B和4C的蛋白质4家族包括在氨基端延伸（含有His标签（SEQIDN0: 5) 和肠激酶蛋白酶位点（SEQIDNO: 9))和羧基端ifreGyrA内含肽变体之间融合的ACT， 所述ifreGyrA内含肽变体分别为天然ifreGyrA、[106(GS)4161]-ifreGyrA和[Cys3， 106(GS)4161]-ifreGyrA。所有3种蛋白质主要在可溶性部分中获得，无任何水解（表4)。 在这种情况下，与蛋白质4C相比蛋白质4A和4B的表达水平更高。
[0213] 2. 4.PP-内含肽融合蛋白的表达 包含5A、5B和5C的蛋白质5家族包括在氨基端延伸（含有His标签（SEQIDN0: 5) 和肠激酶蛋白酶位点（SEQIDNO: 9))和羧基端ifreGyrA内含肽变体之间融合的APP， 所述ifreGyrA内含肽变体分别为天然ifreGyrA、[106(GS)4161]-ifreGyrA和[Cys3， 106(GS)4161]-ifreGyrA。蛋白质5A-5C在可溶性部分中获得（表4)。虽然对于蛋白质5A 和5B而言观察到约50%水解，但对于蛋白质5C而言未观察到水解。这与较之于5A和5B， 蛋白质5C的表达水平提高约10-20%有关。
[0214] 2.5.胰岛淀粉样多肽-内含肽融合蛋白的表达 包含7A、7B和7C的蛋白质7家族包括在可通过alp蛋白酶除去的氨基端富含组氨酸 的十三肽延伸（SEQIDN0: 7)和羧基端ifreGyrA内含肽变体之间融合的[Aspl4，Argl7， Pro21，Pro27,Arg35]-人胰岛淀粉样多肽，所述ifreGyrA内含肽变体分别为天然ifre GyrA、[106(GS)4161]-ifreGyrA和[Cys3，106(GS)4161]-ifreGyrA。虽然蛋白质 7A和 7B两 者主要在可溶性部分中获得，蛋白质7C作为可溶性和不溶性蛋白质的混合物获得（表4)。 对于蛋白质7A和蛋白质7B二者而言，观察到大量水解，但未观察到蛋白质7C的工程改造 的内含肽水解。这导致与7A和7B相比，蛋白质7C表达水平提高7-13%。