gy(1988)6:559-563;McCabe等Bio/ Technology(1988) 6:923-926 ;Sanford,Physiol.Plant. (1990) 79:206-209 ;通过使用微 量移液管系统：Neuhaus等，Theor.Appl.Genet. (1987)75:30-36;Neuhaus和Spangenberg， Physiol.Plant. (1990)79:213-217 ;或通过用萌发花粉直接培育DNA，DeWet等在 ExperimentalManipulationofOvuleTissue中，编辑Chapman,G.P.和Mantel1，S. H.及Daniels,W.Longman,London，（1985)第 197-209 页；和Ohta,Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1986)83:715-719。
[0107] 存在将DNA直接转移到植物细胞内的各种方法。在电穿孔中，将原生质体短暂地 暴露于强电场。在显微注射中，使用非常小的微量移液管将DNA直接机械注入细胞内。在 微粒轰击中，DNA被吸附在微弹例如硫酸镁晶体、钨粒或金粒上，并且微弹经物理加速到细 胞或植物组织内。
[0108] 与采用的转化技术无关，一旦鉴定了表达原胶原或胶原的后代，就在使其表达达 到最大限度的条件下进一步栽培此类植物。可通过使用核酸或蛋白质探针（例如抗体）检 验外源mRNA和/或多肽的存在选择由转化植物产生的后代。后一种方法使得表达的多肽 组分的定位成为可能（例如通过探测分级植物提取物）并且因此还检验了植物正确加工和 组装外源蛋白质的潜力。
[0109] 栽培此类植物后，通常收获所述胶原。可在任何时间（例如在成熟期）收获植物 组织/细胞，并且使用提取方法分离原胶原分子。优选地，实现收获使得原胶原仍然处于可 被蛋白酶裂解的状态。根据一个实施方案，由本发明的转基因植物生成粗提取物并且随后 与蛋白酶接触。
[oho] 为了生成去端肽胶原或胶原，可在用蛋白酶培育之前由基因工程化细胞纯化包含 前肽或端肽的胶原，或可选地可在用蛋白酶培育之后纯化。还可选地，可在蛋白酶处理之前 部分纯化包含前肽或端肽的胶原，然后在蛋白酶处理后完全纯化。仍可选地，可伴随其它提 取/纯化程序，用蛋白酶处理包含前肽或端肽的胶原。
[0111] 纯化或半纯化本发明的包含端肽的胶原的示例性方法包括但不限于用硫酸铵等 盐析和/或通过超滤或通过色谱法去除小分子。
[0112] 根据一个实施方案，用于裂解包含前肽或端肽的重组胶原的蛋白酶并非源自动 物。示例性蛋白酶包括但不限于某些植物源蛋白酶例如无花果蛋白酶（EC3. 4. 22. 3)和某 些细菌源蛋白酶例如枯草杆菌蛋白酶（EC3. 4.21. 62)、中性蛋白酶。根据一个特定实施方 案，所述蛋白酶为无花果蛋白酶。本发明人还考虑到重组酶例如rh胰蛋白酶和rh胃蛋白 酶的用途。几种此类酶可购买获得例如来自于无花果树树浆的无花果蛋白酶（Sigma，产品 目录号 #F4125 和EuropeBiochem)、来自于地衣型芽胞杆菌（Bacilluslicheniformis) 的枯草杆菌蛋白酶（Sigma，产品目录号#P5459)、来自于细菌解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)的中性蛋白酶（Novozymes，产品目录号 #PW201041)和TrypZean?，在 玉米中表达的一种重组人胰蛋白酶（Sigma产品目录号#T3449)。
[0113] 不管如何生成或分离胶原，胶原通常溶于其呈单体形式（即非原纤化形式）存在 的酸性溶液中。溶解单体胶原的示例性酸包括但不限于盐酸（HC1)和醋酸。
[0114] 如本文中所用，短语"胶原单体"是指尚未经历原纤维组装过程的单体胶原。
[0115] 所述胶原可以约l-l〇〇mg/ml的浓度存在于酸性溶液中。根据一个特定实施方案， 所述胶原可以约3-20mg/ml的浓度存在于酸性溶液中。可用于溶解胶原单体的HC1的示例 性浓度为约10mMHC1。
[0116] 根据一个实施方案使用约0. 05mM- 50mM浓度的醋酸溶解胶原单体。可用于溶解 胶原单体的醋酸的示例性浓度为约〇.5M醋酸。
[0117] 胶原溶解之后，可任选地处理胶原以便促进其原纤维生成。
[0118] 如本文中所用的术语"原纤维生成"是指呈原纤维形式的可溶性胶原的析出。
[0119] 原纤维生成受熵驱动一水分子从单体表面的损失驱动胶原单体从溶液中析出并 与圆形横截面组装，以便最小化表面积。原纤维生成可按多种方式进行，包括pH中和、增加 温度和/或离子强度。
[0120] 可添加以升高胶原pH的示例性碱性溶液为Na2HP04(pH11.2)。通常，计算碱 性溶液的量使得胶原的最终pH为约7-7. 5(例如7. 4)。通常按1:7-1:9v/v的比率添加 Na2HP04(162mM)〇
[0121] 根据一个特定实施方案，胶原以介于10-50mg/ml之间，更优选介于20-30mg/ml之 间的浓度存在于所述组合物中。
[0122] 为了生成本文所述的组合物，可制备胶原和无机盐的混合物。
[0123] 所述无机盐可为钠盐、氯盐、钾盐、钙盐、镁盐、磷酸盐、硫酸盐或羧酸盐。
[0124] 优选地，所述无机盐选自恥(：1、1((：1、〇8(：1、〇3(：12、〇8?、1((：104、似勵 3和〇3504。
[0125] 根据一个特定实施方案，所述无机盐为CaCl2。
[0126] 添加CaCl2，使其以介于5-100mM之间，更优选介于7_60mM之间，更优选介于 10-50mM之间且更优选介于10-30mM之间的最终浓度存在。
[0127] 根据一个优选实施方案，添加CaCl2，使其以约20mM的最终浓度存在。
[0128] 可向这种混合物中添加附加组分，包括例如附加生物聚合物和/或陶瓷颗粒的效 果。
[0129] 生物聚合物可包括壳聚糖、透明质酸、藻酸盐、明胶、丝、弹性蛋白、聚乳酸和/或 乳酸等，及其组合。
[0130] 可根据本发明的教导使用的颗粒的实例包括但不限于钛酸钙、羟磷灰石（HA)、磷 酸三钙（TCP)、双相磷酸钙及其它磷酸钙和钙-磷化合物、羟磷灰石钙盐、珊瑚羟磷灰石、碳 酸钙无机骨、牙釉质、霰石、方解石、珍珠母、石墨、热解碳、生物玻璃、生物陶瓷及其混合物。
[0131] 在添加无机盐之前，原纤化胶原可经交联。纤维的交联可使用以下方法中的任一 种实现：1.在N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)、PEG树枝状大分子和多臂PEG、京尼平（genipin) 或其它化学交联剂存在或缺乏时，用戊二醛、N-乙基-Ν' -[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺 (EDC) ;2.通过使用不同的糖糖化；3.通过使用金属离子例如铜进行芬顿反应（Fenton reaction) ;4.用赖氨酸氧化酶；5.通过紫外线福射（例如在光引发剂如4-(2-羟基乙氧 基）苯基-(2-羟基-2-丙基）酮-Irgacure2959的存在下）或6.通过脱氢热（DHT)交 联。
[0132] 本发明考虑到交联也可在添加无机盐之后实现（例如可添加无机盐，之后使用 DHT进行交联）。
[0133] 根据一个实施方案，EDC的浓度选为在10_50mM的范围内。
[0134] 根据另一个实施方案，实现DHT交联的天数介于1和5天之间。
[0135] 如下文进一步所描述，根据凝块稳定性和生长因子释放的需要选择交联剂的量和 /或胶原交联的时间的量。
[0136] 在生成胶原/无机盐混合物之后，可任选地干燥所述混合物。
[0137] 根据一个特定实施方案，胶原/盐混合物经冷冻并且冷冻-干燥。
[0138] 通常，冷冻-干燥通过使用标准商用冷冻-干燥设备完成。在一个特定实施方案 中，混合物的冷冻-干燥利于到处多孔结构的形成。
[0139] 在任选干燥阶段之后，混合物与PRP接触。应了解如果混合物经干燥，则还考虑到 了用适合液体预水合。此类液体包括生理缓冲液（例如PBS)和/或贫血小板血浆（PPP) 溶液。
[0140] 短语贫血小板血浆（PPP)是指具有极少量的血小板（通常低于10X103/μL)的血 浆。
[0141] 通常由制备PRP的相同全血样品制备ΡΡΡ。
[0142] 生成的组合物可呈液态或半固态。例如在低于约37°C的温度下，组合物呈液态。 当温度为约37°C时，发生PRP的活化并且生成胶状物质（凝块）。
[0143] 优选地所述组合物能够在体外在37 °C下在约5-10分钟内，更优选在介于约6-7分 钟之间产生凝块。
[0144] 本发明人提出当成半固态或固态时胶原纤维使凝块转化为可缝合的组合物。
[0145] 正如所提到的，组合物中组分的比率和组分的状态（例如交联或非交联胶原）指 示凝块的物理参数。
[0146] 因此，根据另一方面，提供了一种包含胶原、富血小板血浆（PRP)和无机盐的物质 组合物，其在体外条件下在37°C下培育10天后能够释放超过3000pg/ml的血小板源生长因 子（TOGF)。
[0147] 测定生长因子的方法在本领域中已知，包括例如免疫测定法、Western印迹和实时 PCR〇
[0148] 根据另一个实施方案，所述组合物在体外条件下在37°C下培育10天后能够释放 超过3500pg/ml的血小板源生长因子（PDGF)。
[0149] 根据另一个实施方案，所述组合物在体外条件下在37°C下培育10天后能够释放 超过4000pg/ml的血小板源生长因子（PDGF)。
[0150] 根据另一个实施方案，所述组合物在体外条件下在37°C下培育10天后能够释放 超过4500pg/ml的血小板源生长因子（PDGF)。
[0151] 根据另一个实施方案，所述组合物在体外条件下在37°C下培育10天后能够释放 超过5000pg/ml的血小板源生长因子（PDGF)。
[0152] 根据另一方面，提供了一种包含胶原、富血小板血浆（PRP)和无机盐的物质组合 物，其在体外条件下在37°C下培育20天后耐降解。
[0153] 根据另一个实施方案，所述物质组合物在体外条件下在37°C下培育约25天后耐 降解。
[0154] 根据另一个实施方案，所述物质组合物在体外条件下在37°C下培育约30天后耐 降解。
[0155] 根据另一个实施方案，所述物质组合物在体外条件下在37°C下培育约35天后耐 降解。
[0156] 根据另一个实施方案，所述物质组合物在体外条件下在37°C下培育约40天后耐 降解。
[0157] 本文公开的组合物通常用于治疗伤口和/或组织再生。
[0158] 因此，根据本发明的另一方面提供了一种在有需要的受试者中治疗伤口或诱导组 织再生的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文描述的物质组合物，从而治疗 伤口或诱导组织再生。
[0159] 可使用本文描述的方法治疗的受试者通常为哺乳动物，更优选为人。
[0160] 根据一个优选实施方案，用于制备组合物的PRP为受治受试者自体的。
[0161] 可使用本文描述的组合物修复的组织包括例如软骨、半月板、韧带、腱、骨、皮肤、 骨、手术伤口、角膜、牙周组织、上颂面组织、颞下颂组织、脓肿、切除肿瘤和溃疡。
[0162] 本文描述的PRP组合物（即PRP、胶原和无机盐）可在紧急情况下或作为非必要性 手术的一部分向患者递送。为治疗受损结缔组织，PRP组合物可在组织损伤发生几天、几周、 几个月或几年后作为住院患者或门诊患者手术的一部分递送。可使用PRP治疗的结缔组织 损伤的实例包括但不限于外侧上髁炎（即，肘部发炎）、足底筋膜炎、膝盖骨肌腱炎（即，跳 跃者膝（Jumper'sKnee))、跟腱炎（Achillestendonitis)、肩袖肌腱炎、踝关节扭伤和韧 带撕裂（部分或全部）。可使用一种或多种医学成像技术例如但不限于X-射线成像、磁共 振成像（MRI)和超声成像鉴定组织损伤。为治疗对心肌的损伤，在MI经鉴定时可在急救室 和/或由紧急医疗服务机构递送PRP组合物。在其它情况下，可在MI后在再灌注治疗期间 递送PRP组合物。
[0163]PRP组合物可按任何适合剂量递送。在一些实施方案中，剂量可介于约lcc和约 3cc之间，介于3cc和约5cc之间，介于约5cc和约10cc之间，介于约10cc和约20cc之间， 或更多。可根据医疗程序（例如，在手术中的特定时间点）和/或根据时间表递送所述剂 量。
[0164] 在一些实例中，可向受伤关节内或周围的受损结缔组织递送PRP组合物。可通过 使用注射器或导管注射向有需要的个体递送PRP组合物。PRP组合物也可经由皮肤贴片、喷 雾装置或与软膏、骨移植物或药物组合递送。PRP组合物可