包含免疫刺激性寡核苷酸的新颖疫苗组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于增强利什曼虫和马病毒疫苗的免疫反应的新颖佐剂。
【背景技术】
[0002] 马疱疹病毒是造成病毒诱发的流产、神经疾病（诸如轻瘫）、上呼吸道感染以及新 生马驹疾病（NFD)的主要的马病原体。NFD由接近产期的胎儿经胎盘感染引起，这些胎儿出 生时很虚弱，患有严重呼吸疾病并且一些因EHV-1所致的肝感染而带有黄疸。这些动物通 常在出生后几天内死亡。马鼻肺炎病毒（EHV-4)是急性呼吸道疾病（"鼻肺炎"）的主要原 因并且使大多数马在其生命的最初两年期间受感染。鼻肺炎的特征为发烧、厌食以及大量 浆液性鼻涕，其稍后变成粘液脓性的。在很少情况下，EHV4感染导致怀孕的母马流产。此 外，EHV1和EHV4建立持久的终身潜伏性感染。在重新活化后，病毒引起复发性疾病，伴随 有病毒脱落并且传播至其它动物。
[0003]马疱疹病毒感染和其疾病的控制仍然是不足的，特别是针对EHV1介导的流产、轻 瘫以及由接近产期的胎儿经胎盘感染引起的新生马驹疾病。尽管灭活的以及修饰活的疫苗 是可用的，但没有一种疫苗似乎能充分地阻断感染，也不能阻止由野生型病毒建立潜伏期。 因此，非常需要对这些病毒的田间感染、特别是对EHV1引起的感染具有改善的防护的安全 疫苗。
[0004] 利什曼虫病是人类、犬科动物（狗、狼、狐狸、郊狼、豺）以及猫科动物（狮、虎、 家猫、野猫、其它大型猫，以及其它猫科动物，包括猎豹和猞猁）的主要和严重的寄生虫疾 病。利什曼虫病的作用物是原生动物寄生虫并且属于杜氏利什曼虫复合体（leishmania donovanicomplex)。这种寄生虫广泛分布于南欧、非洲、亚洲、南美洲以及中美洲的温带 和亚热带国家（DesjeuxP.，Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg.，2001，95:239-43)。杜氏利什曼 虫婴儿亚种（Leishmaniadonovaniinfantum，L.infantum)在南欧、非洲以及亚洲造成猫 和犬疾病。在南美洲和中美洲，作用物是杜氏利什曼虫恰加斯亚种（Leishmaniadonovani chagasi，L.chagasi)，其与杜氏利什曼虫婴儿亚种密切相关。在人类中，作用物是杜氏利什 曼虫杜氏亚种（Leishmaniadonovanidonovani，L.donovani)，其与杜氏利什曼虫婴儿亚 种和杜氏利什曼虫恰加斯亚种密切相关。
[0005] 这些寄生虫引起内脏利什曼虫病和/或皮肤利什曼虫病。内脏利什曼虫病导致如 发烧、恶病质、肝脾肿大（肝和脾的扩大）以及血细胞减少的临床症状。皮肤利什曼虫病以 变化的呈现形式出现，从自限并且甚至自愈的皮肤形式至致命的全身性疾病。皮肤利什曼 虫病的病灶可以在身体上的任何地方出现，但最常见的部位是暴露于环境并且因此更易于 被沙蝇叮咬的那些。最初的丘疹快速地产生溃疡。全身性利什曼虫病是罕见的，但如果不 即时治疗的话必定是致命的。全身性利什曼虫病影响内部身体器官，特别是脾和肝。
[0006] 在犬中，疾病与皮肤症状或内脏症状相关联或与皮肤和内脏症状两者相关联，并 且在缺乏疗法的情况下是致命的。
[0007] 已经描述了众多治疗，但没有一者是完全令人满意的，这归因于治疗本身的毒性 或动物复发的趋势。
[0008] 因此，需要新疫苗配方来保护家养动物免受EHV和利什曼虫感染。
【发明内容】
[0009] 本发明解决了本领域的缺陷，这是通过在一个方面提供一种疫苗组合物，其包含 选自由EHV抗原或利什曼虫抗原组成的群组的抗原组分和佐剂组分，其中这种佐剂组分包 含P类免疫刺激性寡核苷酸以及皂苷与留醇的组合；或包含油和任选的一种或多种乳化剂 的油相，所述油相占疫苗组合物的2-20%v/v。
[0010] 在一组实施方案中，可以经过修饰和/或稳定的P类免疫刺激性寡核苷酸以每剂 20-500μg，例如每剂100-250μg的量存在。
[0011] 在一组实施方案中，佐剂组分包含皂苷，诸如QuilA或其纯化的级分，和留醇，诸 如胆甾醇，各自以介于约5-100yg/ml之间的量存在。在一个特定实施方案中，QuilA和 胆甾醇中的每一者以50μg/ml的量存在。
[0012] 在另一个实施方案中，油和任选的至少一种乳化剂（例如，两种乳化剂）存在，并 且油相占疫苗组合物的2-20%v/v(例如，约5%至约10% )。在一个特定实施方案中，油 是SP油。
[0013] 在本发明的某些实施方案中，疫苗配方是非脂质体。
【具体实施方式】
[0014] 提供以下非限制性定义用于更好地理解本发明：
[0015] "约"或"近似"当结合可测量的数值变量使用时，指的是变量的指示值和在指示值 的实验误差内（例如，在平均值的95%置信区间内）或在指示值的10%内（取较大者）的 变量的所有值，除非约是关于以周为单位的时间间隔使用，其中"约3周"是17至25天，并 且约2至约4周是10至40天。
[0016] "佐剂"意指增加对抗原的体液或细胞免疫反应的任何物质。佐剂一般用于实现两 个目的：减缓抗原从注射部位的释放，和刺激免疫系统。
[0017] "抗体"指的是作为对特异性抗原的免疫反应的结果可以结合至那种抗原的免疫 球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有"恒定"和"可变"区的"轻"和"重"多肽链组成的血清 蛋白并且基于恒定区的组成而分成几类（例如，IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM)。
[0018] "抗原"或"免疫原"指的是刺激免疫反应的任何物质。这个术语包括杀死的、灭活 的、减弱的或修饰活的细菌、病毒或寄生虫。术语抗原还包括多核苷酸、多肽、重组蛋白、合 成肽、蛋白提取物、细胞（包括肿瘤细胞）、组织、多糖或脂质、或其片段，个别地或以其任何 组合形式。术语抗原还包括抗体，诸如抗独特型抗体或其片段，以及可以模拟抗原或抗原决 定簇（表位）的合成肽模拟表位。
[0019] "菌苗"意指可以用作疫苗或免疫原性组合物的组分的一种或多种杀死的细菌的 悬浮液。
[0020] "缓冲液"意指防止另一种化学物质的浓度改变的化学系统，例如，质子供体和受 体系统充当防止氢离子浓度（pH)显著改变的缓冲液。缓冲液的另一个实例是含有弱酸和 其盐（共辄碱）或弱碱和其盐（共辄酸）的混合物的溶液。
[0021] "细胞免疫反应"或"细胞介导的免疫反应"是由T淋巴细胞或其它白血球或两者 介导的免疫反应，并且包括由活化的Τ细胞、白血球或两者产生的细胞因子、趋化因子以及 类似分子的产生。
[0022] 如应用于佐剂配方的"基本上由……组成"指的是配方不含一定量的未列举的额 外辅助或免疫调节剂，在这些量下所述试剂发挥可测量的辅助或免疫调节作用。
[0023] "剂量"指的是给予受试者的疫苗或免疫原性组合物。"第一剂量"或"引发疫苗" 指的是第〇天给予的这类组合物的剂量。"第二剂量"或"第三剂量"或"年剂量"指的是继 第一剂量之后给予的这类组合物的量，其可能是或可能不是与第一剂量相同的疫苗或免疫 原性组合物。
[0024] "体液免疫反应"指的是由抗体介导的免疫反应。
[0025]受试者中的"免疫反应"指的是对抗原的体液免疫反应、细胞免疫反应、或体液和 细胞免疫反应的发展。免疫反应通常可以使用本领域中已知的标准免疫试验和中和试验来 测定。
[0026] 抗原的"免疫保护量"或"免疫有效量"或"产生免疫反应的有效量"是有效诱导 接受者中的免疫原性反应的量。免疫原性反应可以充分用于诊断目的或其它测试，或可以 足以预防由疾病作用物的感染引起的疾病的征象或症状，包括对健康不利的影响或其并发 症。可以诱导体液免疫或细胞介导的免疫或两者。动物对免疫原性组合物的免疫原性反应 可以例如间接地经由测量抗体效价、淋巴细胞增殖试验，或直接地经由在用野生型病毒株 攻击后监测征象和症状来评价，而由疫苗赋予的保护性免疫可以通过测量例如受试者的临 床征象的减少来评价，这些临床征象诸如死亡率、发病率、温度准数、总体身体状况以及总 体健康和表现。免疫反应可以包含（但不限于）细胞和/或体液免疫的诱导。
[0027] "免疫原性"意指引出免疫或抗原性反应。因此，免疫原性组合物将为诱导免疫反 应的任何组合物。
[0028] "免疫刺激性分子"指的是产生免疫反应的分子。
[0029] "脂质"指的是不可溶于水，但可溶于非极性有机溶剂，触摸呈油性，并且与碳水化 合物和蛋白质一起构成活细胞的主要结构物质的一组有机化合物中的任一者，包括脂肪、 油、蜡、甾醇以及甘油三酯。
[0030] "医药学上可接受的"指的是在合理医学判断的范围内适合用于与受试者的组织 接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应等等，与合理的效益风险比相匹配，并且有效用于 其预期用途的物质。
[0031] "反应原性"指的是在受试者中对施用佐剂、免疫原性或疫苗组合物有反应而引发 的副作用。其可以在施用部位出现，并且通常依据许多症状的发展来评估。这些症状可以 包括发炎、发红以及脓肿。其还依据出现情况、持续时间以及严重性来评估。"低"反应将例 如涉及仅可通过心悸检测到并且不被眼睛检测到，或将持续时间很短的膨胀。更严重的反 应将为例如眼睛可见或持续时间更长的反应。
[0032] "室温"意指18至25°C的温度。
[0033] "皂苷"指的是植物来源的一组表面活性糖苷，其由与甾体或三萜结构的疏水区缔 合的亲水区（通常是几