专利名称：一种免疫防龋dna疫苗及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于口腔预防医学技术领域，更具体涉及一种编码变形链球菌表面蛋白抗原基因的DNA防龋疫苗及制备方法及其在免疫防龋的应用。
背景技术：
龋病是一种细菌感染性疾病。变形链球菌是主要致龋菌(Streptococcusmutans)，表面蛋白抗原PAc参与介导变形链球菌与牙面唾液获得性膜成份之间的粘附过程，是其主要毒力因子之一(Gibbons RJ，Etherden I Comparativehydrophobicities of oral bacteria and their adherence to salivary pellicles.InfectImmun 1983；411190)(Forester H，Hunter N，Knox KW.Characteristics of a highmolecular weight extracellular protein of Streptococcus mutans.J.Gen Microbiol1983；1292779)。PAc的编码基因pac已被成功克隆并测序，目前研究表明，pac基因中富含丙氨酸的A区和富含脯氨酸的P区为主要的粘附功能区和免疫活性区。
免疫防龋是一种有效的控制龋病的措施，纯化的PAc亚单位疫苗、多肽疫苗和基因工程疫苗防龋研究均证实PAc作为一种良好的免疫原可以有效控制龋病的发生。
Saito等学者采用变形链球菌表面蛋白抗原(PAc)和粘膜佐剂霍乱毒素A亚单位突变体(mCT E112K)共同经鼻粘膜免疫小鼠，结果在唾液和鼻腔分泌物中检测到明显的特异的分泌型抗PAc抗体，同时在颌下腺和鼻腔中检测到大量分泌特异分泌型抗PAc抗体的形成细胞，体外再刺激后发现颈淋巴结CD4(+)细胞明显增殖。而且免疫小鼠后，可以显著降低口腔变链菌的聚集。说明PAc和mCT E112K复合体有望成为有效的粘膜防龋疫苗(Saito，M.，S.Otake，et al.2001.Protective Immunity to Streptococcus mutans Induced by Nasal Vaccinationwith Surface Protein Antigen and Mutant Cholera Toxin Adjuvant.J InfectDis 183(5)823-826.)。Oishi等认为单独用一种源于PAc蛋白A区的13肽免疫动物几乎不能产生抗体，但是在二聚肽间加入氨基酸残基，尤其是赖氨酸片段，可以明显增强PAc蛋白A区的13肽的抗原性(Oishi，Y.，A.Onozuka，et al.2001.The effect of amino acid spacers on the antigenicity of dimeric peptide-inducing cross-reacting antibodies to a cell surface protein antigen ofStreptococcus mutans.Oral Microbiol Immunol 16(1)40-44)。
然而以上的各种防龋多肽疫苗存在许多不足之处，首先是这些多肽制备纯化困难，一般需耗时数周且费用昂贵，保存需要特殊条件；其次，多肽防龋疫苗刺激机体产生有效的免疫反应的能力较差，常需添加各种对人体有害的免疫佐剂；多肽防龋疫苗与其它多肽疫苗一样，诱导特异性免疫反应的持续时间一般较短，需反复多次接种才能达到较满意的效果；另外多肽疫苗一般不能诱导婴幼儿产生免疫反应。(Kowalczyk DW，Ertl HCJ.1999.Immune responses to DNAvaccines.CMLS，Cell.Mol.Life Sci.，55751-770)。
发明内容
本发明的目的是提供了一种免疫防龋DNA疫苗，将编码变形链球菌表面蛋白PAc的A区和P区基因克隆至真核表达载体pCI中。
本发明的另一个目的是提供一种制备防龋DNA疫苗的制备方法，安全性高，能表达天然抗原，生产成本低廉，方法简单。
本发明的再一个目的是将本发明免疫防龋DNA疫苗在鼻粘膜、胃肠道粘膜和生殖道粘膜的免疫防龋应用。
本发明所提供的大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pCIA-P，CCTCC NOM201041。其特征在于采用DNA体外重组技术，以聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)，采用正链引物5’TAG GCT CGA GAA ATG GCT GCC AATCAA GCA 3’及负链引物5’CCC GGG GTC GAC TTA CTC ATA AGT TGG CTC3’，从携带有PAc编码基因pac的质粒pPC41中扩增出编码A区和P区的基因A-P片段；再将此PCR产物克隆至pGEM-T载体中；将筛选后的阳性重组质粒与真核表达载体pCI经同一组限制性内切酶(Sma I、Xho I)处理后定向克隆，构建成携带有变形链球菌表面蛋白抗原PAc重要抗原决定簇的编码基因A-P片段的真核表达质粒pCIA-P。与其它DNA疫苗相比，pCIA-P具有巨细胞病毒CMV的早期启动子/增强子(CMV immediate-early ehancer/promoter)，该启动子增强表达的能力显著高于其它如劳斯肉瘤病毒启动子LTR、猴病毒40(SV40)等启动子；pCIA-P的辅助增强表达成分中还含有人β球蛋白基因内含子序列，细胞转染及表达实验表明，该内含子序列可显著增加基因表达，较之仅有CMV启动子而无此内含子的另一个优秀真核表达质粒pcDNA3(Invitrogen公司)，pCIA-P的表达能力要强10到40倍。pCIA-P质粒中的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)内含有两个5’-AACGTT-3’拷贝，该拷贝属于免疫刺激DNA序列(Immunostimulatory DNA sequence，ISS)，具有诱导机体产生IFN等细胞因子，促进机体对抗原的免疫应答的作用。
与多肽防龋疫苗相比，pCIA-P DNA防龋疫苗具有以下优点①pCIA-P质粒物理化学性质稳定，常温下即可保存，便于运输使用，而多肽疫苗一般需要低温冷藏保存等特殊条件；②pCIA-P简化了疫苗的生产步骤，仅需完成基因工程的上游部分，省却了下游重组多肽的表达和纯化过程，短时间内可以得到大量的质粒，而且pCIA-P质粒的纯化方法较为简单且产物纯度很高，而多肽疫苗制备纯化相对困难复杂，一般需耗时数周；③多肽防龋疫苗激发机体产生免疫反应的能力较差，需要添加各种免疫佐剂，但这些佐剂经常引起严重的炎症反应，大大限制了多肽疫苗的应用，而pCIA-P DNA疫苗本身含有CpG免疫刺激序列可以作为免疫佐剂显著提高机体对pCIA-P的免疫反应，避免使用各种对人体有害的佐剂；④多肽疫苗一般不能诱导婴幼儿产生免疫反应，但pCIA-P疫苗可以接种乳鼠诱导特异性抗PAc抗体，该特点十分有利于保护儿童中的龋病易感人群；⑤pCIA-P如同其他DNA疫苗一样在被以任何途径输入体内后，都可能在被转染的少量细胞中长期表达A-P重组蛋白，不断地刺激机体的免疫系统，诱导长时间的免疫反应。相反多肽疫苗在体内很不稳定易被蛋白酶降解，因而要接种较大量才能引起明显的免疫反应，且要多次接种以维持效果。⑥目的DNA片段在pGEM-T载体系统中的亚克隆使PCR产物明显提高。由于Taq DNA聚合酶具有非模板依赖性而能在双链DNA分子的3’末端添加一个腺嘌呤，因此，PCR产物的DNA 3’末端均有一个突出的A。pGEM-T即根据此特性而设计出的PCR产物克隆专用载体系统，在其线性化的质粒DNA两端均各有一个突出的胸腺嘧啶，根据A-T互补的原理，即可明显提高PCR产物克隆至载体质粒的效率。
图1 pCIA-P防龋DNA疫苗结构示意图CMV immediate-early enhancer/promoter巨细胞病毒早期启动子/增强子
Chimeric intron人β球蛋白基因内含子序列T7promoter T7噬菌体启动子A-P fragment A-P重组DNA片段SV40 late polyA signal SV40病毒晚期加尾信号Phage f1 region丝状噬菌体f1复制子SmaI(3319) 限制性内切酶SmaI的酶切位点XhoI(1058) 限制性内切酶XhoI的酶切位点AmpR 氨苄青霉素抗性基因pCIA-P含有变形链球菌表面蛋白抗原PAc重要抗原决定簇的编码基因A-P片段，具有巨细胞病毒CMV的早期启动子/增强子(CMV immediate-earlyehancer/promoter)，该启动子增强表达的能力显著高于其它如劳斯肉瘤病毒启动子LTR、猴病毒40(SV40)等启动子；pCIA-P的辅助增强表达成分中还含有人β球蛋白基因内含子序列，pCIA-P质粒中的氨苄青霉素抗性基因(AmpR)内含有两个5’-AACGTT-3’拷贝，该拷贝属于免疫刺激DNA序列(ImmunostimulatoryDNA sequence，ISS)，具有诱导机体产生IFN等细胞因子，促进机体对抗原的免疫应答的作用。SV40晚期polyA信号能在RNA多聚酶II的作用下终止转录，并在RNA转录体的3’端加上约200至250个腺嘌呤残基。这种polyA结构能增强RNA的稳定与其后的翻译。f1复制子为丝状噬菌体f1的复制源，便于质粒在大肠杆菌中复制。T7噬菌体启动子为一优良的原核启动子，可以调控A-P片段的表达。图2 pCIA-P防龋DNA疫苗的限制性内切酶酶切分析电泳示意图1 pCI经XhoI酶切得到4.0kb片段2 pCIA-P经Bgl II酶切得到4.5kb和1.7kb两个片段3 pCIA-P经XhoI酶切得到6.2kb一个片段4 pCIA-P经Sal I和XhoI双酶切得到4.0kb和2.2kb两个片段5 λDNA/HindIII DNA分子量标准图3 重组质粒pCIA-P在大肠杆菌BL-21(DE3)细胞中的表达示意图重组A-P片段在大肠杆菌BL-21(DE3)中的表达显示在Marker的97KDa和66KDa之间出现一条约为82KD左右的蛋白带，与A-P片段预期表达的蛋白质产物分子量相符。
1.蛋白质分子量标准物2.含pCIA-P的BL-21(IPTG诱导)3.含pCIA-P的BL-21(未作诱导)4.含pCI的BL-21(IPTG诱导)
5.BL-21(IPTG诱导)图4 重组质粒pCIA-P在人血管内皮细胞株ECV-304中的表达示意图重组质粒pCIA-P转染后的ECV-304细胞胞浆内出现褐色的特异性表达产物。(SABC法，苏木素衬染，×20)图5 定菌鼠血清和唾液中特异性抗PAc抗体水平示意图。图6 定菌鼠Keyes龋齿计分结果示意图。图7 pCIA-P经鼻粘膜免疫定菌鼠的龋齿记分结果示意图。A组为裸DNA组，B组为Dosper-DNA组，C组为Bupivacaine-DNA组，D组为空载体pCI对照组，E组为无菌水阴性对照组E釉质龋DS轻度牙本质龋Dm中度牙本质龋图8 pCIA-P经胃肠粘膜免疫定菌鼠的龋齿记分结果示意图。
A组 裸DNA灌胃组B组 Bupivacaine-DNA灌胃组C组 经直肠接种裸DNA组D组 经直肠接种Bupivacaine-DNA复合体E组 裸DNA股四头肌注射组F组 无菌水阴性对照组图9 pCIA-P经鼻粘膜免疫定菌鼠的特异性抗体检测结果示意图。
B组 Dosper-DNA组，C组 Bupivacaine-DNA组D组 空载体pCI对照组E组 无菌水阴性对照组，图10 pCIA-P经胃肠粘膜免疫定菌鼠的特异性抗体检测结果示意图。
A组 裸DNA灌胃组B组 Bupivacaine-DNA灌胃组C组 经直肠接种裸DNA组D组 经直肠接种Bupivacaine-DNA复合体E组 裸DNA股四头肌注射组F组 无菌水阴性对照组
具体实施例方式
下面根据附图对本发明作进一步详细描述根据图1-10可知，pac基因待表达DNA片段的设计与制备运用DNASIS计算机软件包对主要致龋菌变形链球菌重要毒力因子PAc蛋白的结构基因pac全序列进行了限制性内切酶识别位点、开放阅读框、遗传密码子、编码蛋白等结构参数分析，并结合有关文献对pac基因分子克隆的背景资料进行了研究分析，从而使pac基因的克隆工程的数据背景清晰化。同时对高效真核表达质粒pCI的DNA一级结构进行了DNASIS软件包分析，以利于含pac基因待表达片段重组质粒克隆构建方案的准确制订。
选定pac基因中含重要抗原决定簇的保守区域(A区及P区)的DNA序列，设计出两端分别带有限制性内切酶XhoI与SmaI酶切识别序列及起始、终止密码的一对引物(正链引物5’TAG GCT CGA GAA ATG GCT GCC AAT CAAGCA 3’及负链引物5’CCC GGG GTC GAC TTA CTC ATA AGT TGG CTC 3’)，运用多聚酶链反应技术使用Expand高保真Taq DNA聚合酶建立PCR反应体系，从带有Streptococcus mutans表面蛋白PAc编码基因的重组质粒pPC41中扩增出两端带有限制性内切酶XhoI与Sma I的酶切识别序列及起始、终止密码的目的DNA片段；在T4DNA连接酶作用下，将PCR扩增的目的DNA片段与pGEM-T质粒载体连接，利用蓝白斑筛选方法获得携带A-P片段的重组体pGEM-T/A-P；以限制性内切酶XhoI与SmaI对重组质粒pGEM-T/A-P和真核表达质粒pCI分别进行酶切，在T4DNA连接酶作用下，目的DNA片段定向克隆至载体质粒pCI中，完成了含变链菌pac基因重要抗原编码区的重组质粒pCIA-P的克隆构建(见图1)经过多组限制性内切酶的酶切电泳鉴定，证实所构建的6.2kb重组质粒pCIA-P是由2.2kb pac基因重要抗原编码区DNA与4.0kb真核表达质粒pCI组成(图2)。经Sanger双脱氧链终止法对重组体进行测序分析证实克隆片段插入位点及阅读框正确，测得序列与发表序列之间核苷酸同源性为99.82％。仅个别碱基有突变，可以编码目的蛋白(附表1)。附表1 重组质粒pCIA-P与pac基因发表序列的核苷酸同源性比较碱基错误pac基因发表序列pCIA-P插入片段DNA序列*(序号) 位点 碱基 位点碱基1 2234 C1377G2 2244 A1387G3 2281 G1424A4 2282 A1425G*位点顺序自起始密码ATG开始计数。
重组质粒pCIA-P在大肠杆菌BL-21(DE3)细胞中的表达本研究中的S.mutans表面蛋白编码基因为原核基因，在选择合适的原核表达系统后，可使外源基因表达出目的蛋白，通过蛋白质电泳技术及免疫印迹法检测表达蛋白，以观察pac基因重要抗原决定簇编码区DNA片段在原核细胞中的表达情况。在本研究中，重组DNA的载体质粒pCI具有T7噬菌体启动子，其为一优良的原核启动子，可以调控表达原核基因，因此，在T7噬菌体RNA聚合酶存在的前提下，该表达质粒可在原核细胞中表达插入其下游的外源基因。而大肠杆菌BL-21(DE3)的基因由于可表达T7噬菌体RNA聚合酶，所以该细菌与带有T7噬菌体启动子的载体质粒pCI共同构成表达克隆基因的原核表达系统中的两个必需组分。本实验将含有pac基因重要抗原决定簇编码区DNA片段的重组体pCIA-P转化至大肠杆菌BL-21(DE3)中，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导外源基因表达，将培养物制样后进行蛋白质电泳(图3)及Western检测以证实克隆片段在原核启动子T7下可完成表达，蛋白质凝胶电泳显示在Marker的97KDa和66KDa之间出现一条约为82KDa左右的蛋白带，与克隆片段(2244bp，编码含748个氨基酸的蛋白质)预期表达的蛋白质产物分子量相符。
重组质粒pCIA-P在人血管内皮细胞株ECV-304中的表达运用阳离子脂质体介导细胞转染技术，将重组质粒pCIA-P导入人血管内皮细胞株ECV-304，通过ABC法免疫组织化学方法使表达产物呈色，观察证实在重组质粒pCIA-P转染后的ECV-304细胞胞浆内出现褐色的特异性表达产物。从而进一步证实重组DNA疫苗构建及特异性表达的成功(图4)。
DNA疫苗应用研究采用股四头肌肌肉注射、颌下腺区皮下注射免疫和颊粘膜下注射三种方法免疫定菌鼠，实验分组见附表2。附表2定菌鼠实验分组和免疫途径组别免疫原(100μg/μl)免疫途径A 重组质粒pCIA-P股四头肌注射(im)B 重组质粒pCIA-P颌下腺周围区域皮下注射(TSG)C 重组质粒pCIA-P颊粘膜下注射(bucca)D 空载体质粒pCI 股四头肌注射(pCI)E 生理盐水 股四头肌注射(NS)ELISA法检测血清和唾液中特异性抗体水平，发现大鼠血清及唾液中特异性抗体水平分析显示，各组血清中特异性抗PAc-IgG和抗PAc-IgA抗体水平有明显差异(p＜0.01)，A、B、C三组间有显著差异(p＜0.01)，其中A组最高。各组唾液中特异性抗PAc-IgG和抗PAc-IgA抗体水平也有明显差异(p＜0.01)，B、C两组唾液中抗PAc-IgG和PAc-IgA抗体水平明显高于其他三组(P＜0.01)，但B、C两组之间IgA抗体无显著性差异(P＞0.05)，但C组IgG抗体显著高于B组(p＜0.05)。结果表明，pCIA-P经股四头肌注射，颊粘膜下注射和颌下腺区皮下注射均能显著增加血清中抗PAc-IgG、抗PAc-IgA和唾液中抗PAc-IgG抗体水平，而发现颌下腺区皮下注射免疫的方法可显著增加唾液中抗PAc-IgA水平和血清中特异性抗PAc-IgG水平(见图5)。Keyes计分法评估免疫定菌鼠后鼠磨牙患龋情况。结果表明，疫苗免疫组釉质龋与牙本质龋记分均比D、E两组低(p＜0.01)。B、C两组釉质龋和牙本质中龋计分明显低于A组(P＜0.01)，B、C两组间差异无显著性(P＞0.05)。B组Ds记分显著低于A组(p＜0.01)，A、C组间，B、C两组间差异无显著性重组质粒免疫定菌鼠后能显著降低定菌鼠龋损计分。特别是颌下腺区皮下注射免疫组和颊粘膜下注射免疫组，大鼠牙本质龋的破坏程度明显低于其他组(见图6)。
粘膜组织是机体抵御病原体入侵的第一道防线，粘膜免疫在机体免疫中地位重要，免疫途径主要包括鼻粘膜、胃肠道粘膜以及生殖道粘膜等。核酸疫苗经粘膜免疫可以诱发机体的体液与细胞免疫，产生特异性IgG与SIgA抗体，后者对于防龋尤为重要。DNA疫苗诱发机体产生抗体的效能与粘膜上皮细胞摄取质粒DNA的能力有关。因此为寻找pCIA-P DNA防龋疫苗的最佳免疫途径，我们用阳离子脂质体Dosper和局部麻醉药Bupivacaine包裹编码基因pac的质粒pCIA-P，制备DNA复合体经鼻粘膜和胃肠粘膜免疫定菌鼠，进行龋齿记分，并检测血清与唾液中的特异性抗体，评价DNA疫苗的效能。经鼻粘膜免疫定菌鼠的结果显示疫苗免疫组血清特异性抗PAc IgG、IgA抗体水平与D、E组有显著差异(p＜0.01，)，B、C、F组特异性抗PAc IgG显著高于A组(P＜0.01)，D、E组间和B、C、F组间无显著差异(P＞0.05)；B、C组特异性抗PAc IgA高于A组(p＜0.05)，F组特异性抗PAc IgA抗体水平显著比B、C组高(p＜0.01)，B、C组间和D、E组间无显著差异(P＞0.05)。各组唾液中特异性抗PAc IgG、IgA抗体水平有显著差异(p＜0.01，)，经粘膜免疫的A、B、C三组特异性抗PAc IgA抗体水平显著高于其它三组(P＜0.01，)，B、C组明显高于A组(P＜0.01)，其它三组无显著差异(p＞0.05)。B、C组特异性抗PAcIgG抗体水平显著高于其它组(p＜0.01)，B、C组间，A、F组间和D、E组间无明显差异(p＞0.05)。粪便总体抗体水平远低于血清与唾液，i.n.不能诱导肠粘膜产生有效的抗体。其中IgG抗体在6组中无差异(p＞0.05，)，虽然A、B、C、D四组IgA水平高于其它两组(p＜0.01)，但疫苗免疫组间无显著差异(p＞0.05，图9)。龋齿记分(图7)结果表明A、B、C、F四组E(牙本质釉质龋)、Ds(牙本质浅龋)、Dm(牙本质中龋)龋齿记分明显低于阴性对照组(P＜0.01)。进一步比较发现，A、B、C三组E、Ds、Dm记分显著低于F组(P＜0.01)，B、C两组的釉质龋记分最低(p＜0.01)，Ds、Dm记分与A组也有显著差异(p＜0.05)。B、C组间，D、E组间无显著差异(p＞0.05)。经胃肠粘膜免疫定菌鼠的结果表明疫苗免疫组样本(粪便除外)特异性抗PAc抗体均显著高于非疫苗免疫组(P＜0.01)。i.m.(肌肉注射组)和DNA复合体免疫组可诱导高水平的血清特异性抗PAcIgG抗体，此三组间无显著差异(P＞0.05)，DNA复合体免疫组分别显著高于相应的裸DNA组(P＜0.01)；i.m.组血清特异性抗PAcIgA抗体水平显著高于其它组(P＜0.01)。疫苗免疫组间唾液特异性抗PAcIgG抗体水平无显著差异(P＞0.05)，粘膜免疫组唾液特异性抗PAcIgA抗体水平显著高于i.m.组(P＜0.01)，Bupivacaine-DNA复合体组与裸DNA相比，显著提高了唾液特异性IgA抗体水平(P＜0.01)。粘膜免疫组血清和唾液中特异性抗体水平以B组为最高。粘膜免疫组在粪便样本中也检测到了显著高于其它组的特异性抗PAcIgG抗体和IgA抗体(P＜0.01)，其它组间无显著差异(P＞0.05)，其中D组特异性IgA抗体水平最高(见图10)。龋齿记分结果(图8)龋齿记分结果表明疫苗免疫组E、Ds、Dm记分显著低于非免疫组(P＜0.01)。胃粘膜免疫组与直肠粘膜免疫组的釉质龋和牙本质龋记分显著低于其它组(P＜0.01)，其它组间无差异(P＞0.05)，Bupivacaine可显著降低粘膜组的龋齿记分(P＜0.01)。复合体组间，胃粘膜组牙本质浅龋记分显著比直肠粘膜组低(P＜0.01)。结果显示编码基因pac的pCIA-P DNA复合体防龋疫苗经粘膜途径进行免疫比肌肉注射免疫预防龋病的效果佳，尤其是经鼻粘膜途径免疫防龋效果最好。
序列表pCIA-P的DNA序列如下TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAAATGGCTGCCAATCAAGCAGCCTATCAAAAAGCCCTTGCTGCTTATCAGGCTGAACTGAAACGTGTTCAGGAAGCTAATGCAGCCGCCAAAGCCGCTTATGATACTGCTGTAGCAGCAAATAATGCCAAAAATACAGAAATTGCCGCTGCCAATGAAGAAATTAGAAAACGCAATGCAACGGCCAAAGCTGAATATGAGACTAAGTTAGCTCAATATCAAGCTGAACTAAAGCGTGTTCAGGAAGCTAATGCCGCAAACGAAGCAGACTATCAAGCTAAATTGACCGCCTATCAAACAGAGCTTGCTCGTGTTCAAAAAGCCAATGCGGATGCTAAAGCGACCTATGAAGCAGCTGTAGCAGCAAATAATGCCAAAAATGCGGCACTCACAGCTGAAAATACTGCAATTAAGCAACGCAATGAGAATGCTAAGGCGACTTATGAAGCTGCACTCAAGCAATATGAGGCCGATTTGGCAGCGGTGAAAAAAGCTAATGCCGCAAACGAAGCAGACTATCAAGCTAAATTGACCGCCTATCAAACAGAGCTCGCTCGCGTTCAAAAAGCCAATGCGGATGCTAAAGCGGCCTATGAAGCAGCTGTAGCAGCAAATAATGCCGCAAATGCAGCGCTCACAGCTGAAAATACTGCAATTAAGAAGCGCAATGCGGATGCTAAAGCTGATTACGAAGCAAAACTTGCTAAGTATCAAGCAGATCTTGCCAAATATCAAAAAGATTTAGCAGACTATCCAGTTAAGTTAAAGGCATACGAAGATGAACAAACTTCTATTAAAGCTGCACTGGCAGAACTTGAAAAACATAAAAATGAAGACGGAAACTTAACAGAACCATCTGCTCAAAATTTGGTCTATGATCTTGAGCCAAATGCGAACTTATCTTTGACAACAGATGGGAAGTTCCTTAAGGCTTCTGCTGTGGATGATGCTTTTAGCAAAAGCACTTCAAAAGCAAAATATGACCAAAAAATTCTTCAATTAGATGATCTAGATATCACTAACTTAGAACAATCTAATGATGTTGCTTCTTCTATGGAGCTTTATGGGAATTTTGGTGATAAAGCTGGCTGGTCAACGACAGTAAGCAATAACTCACAGGTTAAATGGGGATCGGTACTTTTAGAGCGCGGTCAAAGCGCAACAGCTACATACACTAACCTGCAGAATTCTTATTACAATGGTAAAAAGATTTCTAAAATTGTCTACAAGTATACAGTGGACCCTAAGTCCAAGTTTCAAGGTCAAAAGGTTTGGTTAGGTATTTTTACCGATCCAACTTTAGGTGTTTTTGCTTCTGCTTATACAGGTCAAGTTGAAAAAAACACTTCTATTTTTATTAAAAATGAATTCACTTTCTATGACGAAGATGGAAAACCAATTAATTTTGATAATGCCCTTCTCTCAGTAGCTTCTCTTAACCGTGAACATAACTCTATTGAGATGGCTAAAGATTATAGTGGTAAATTTGTCAAAATCTCTGGTTCATCTATTGGTGAAAAGAATGGCATGATTTATGCTACAGATACTCTTAACTTTAAACAGGGTGAAGGTGGCTCTCGCTGGACTATGTATAAAAATAGTCAAGCTGGTTCAGGATGGGATAGTTCAGATGCGCCGAATTCTTGGTATGGAGCAGGGGCTATTAAAATGTCTGGTCCGAATAACCATGTTACTGTAGGAGCAACTTCTGCAACAAATGTAATGCCAGTTTCTGACATGCCTGTTGTTCCTGGTAAGGACAATACTGATGGCAAAAAACCAAATATTTGGTATTCTTTAAATGGTAAAATCCGTGCGGTTAATGTTCCTAAAGTTACTAAGGAAAAACCCACACCTCCGGTTAAACCAACAGCTCCAACTAAACCAACTTATGAAACAGAAAAGCCATTAAAACCGGCACCAGTAGCTCCAAATTATGAAAAGGAGCCAACACCGCCGACAAGGACACCGGATCAAGCAGAGCCAAACAAACCCACACCGCCGACCTATGAAACAGAAAAGCCGTTGGAGCCAGCACCTGTTGAGCCAAGCTATGAAGCAGAGCCAACACCGCCGACAAGGACACCGGATCAGGCAGAGCCAAATAAACCCACACCGCCGACCTATGAAACAGAAAAGCCGTTGGAGCCAGCACCTGTTGAGCCAAGCTATGAAGCAGAGCCAACGCCACCGACACCAACACCAGATCAACCAGAACCAAACAAACCTGTTGAGCCAACTTATGAGTAAGTCGACCCCGGGCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCCGGGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGAGCTTTACGGCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAATATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGGCTCGACAGATCT黑体部分是A-P片段序列。
权利要求
1.一种免疫防龋DNA疫苗，其特征在于大肠杆菌Escherichia coliJM109/pCIA-P CCTCC NOM201041。
2.一种实现权利要求1所述的一种防龋DNA疫苗的制备方法，其特征在于采用正链引物、负链引物；从携带有变形链球菌表面蛋白抗原编码基因pac的质粒pPC41中扩增出编码A区和P区的基因A-P片段；选定pac基因中含抗原决定簇的DNA序列；再将此PCR产物克隆到pGEM-T载体中；将筛选后的阳性重组质粒与真核表达载体pCI经同一组限制性内切酶SmaI、XhoI处理后定向克隆，构建成携带有变形链球菌表面蛋白抗原PAc重要抗原决定簇的编码基因A-P片段的真核表达质粒pCIA-P。
3.根据权利要求1所述的一种免疫防龋DNA疫苗，其特征在于正链引物5’TAG GCT CGA GAA ATG GCT GCC AAT CAA GCA 3’负链引物5’CCC GGG GTC GAC TTA CTC ATA AGT TGG CTC 3’。
4.根据权利要求1所述的一种免疫防龋DNA疫苗，其特征在于pCIA-P的DNA序列为TCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAAATGGCTGCCAATCAAGCAGCCTATCAAAAAGCCCTTGCTGCTTATCAGGCTGAACTGAAACGTGTTCAGGAAGCTAATGCAGCCGCCAAAGCCGCTTATGATACTGCTGTAGCAGCAAATAATGCCAAAAATACAGAAATTGCCGCTGCCAATGAAGAAATTAGAAAACGCAATGCAACGGCCAAAGCTGAATATGAGACTAAGTTAGCTCAATATCAAGCTGAACTAAAGCGTGTTCAGGAAGCTAATGCCGCAAACGAAGCAGACTATCAAGCTAAATTGACCGCCTATCAAACAGAGCTTGCTCGTGTTCAAAAAGCCAATGCGGATGCTAAAGCGACCTATGAAGCAGCTGTAGCAGCAAATAATGCCAAAAATGCGGCACTCACAGCTGAAAATACTGCAATTAAGCAACGCAATGAGAATGCTAAGGCGACTTATGAAGCTGCACTCAAGCAATATGAGGCCGATTTGGCAGCGGTGAAAAAAGCTAATGCCGCAAACGAAGCAGACTATCAAGCTAAATTGACCGCCTATCAAACAGAGCTCGCTCGCGTTCAAAAAGCCAATGCGGATGCTAAAGCGGCCTATGAAGCAGCTGTAGCAGCAAATAATGCCGCAAATGCAGCGCTCACAGCTGAAAATACTGCAATTAAGAAGCGCAATGCGGATGCTAAAGCTGATTACGAAGCAAAACTTGCTAAGTATCAAGCAGATCTTGCCAAATATCAAAAAGATTTAGCAGACTATCCAGTTAAGTTAAAGGCATACGAAGATGAACAAACTTCTATTAAAGCTGCACTGGCAGAACTTGAAAAACATAAAAATGAAGACGGAAACTTAACAGAACCATCTGCTCAAAATTTGGTCTATGATCTTGAGCCAAATGCGAACTTATCTTTGACAACAGATGGGAAGTTCCTTAAGGCTTCTGCTGTGGATGATGCTTTTAGCAAAAGCACTTCAAAAGCAAAATATGACCAAAAAATTCTTCAATTAGATGATCTAGATATCACTAACTTAGAACAATCTAATGATGTTGCTTCTTCTATGGAGCTTTATGGGAATTTTGGTGATAAAGCTGGCTGGTCAACGACAGTAAGCAATAACTCACAGGTTAAATGGGGATCGGTACTTTTAGAGCGCGGTCAAAGCGCAACAGCTACATACACTAACCTGCAGAATTCTTATTACAATGGTAAAAAGATTTCTAAAATTGTCTACAAGTATACAGTGGACCCTAAGTCCAAGTTTCAAGGTCAAAAGGTTTGGTTAGGTATTTTTACCGATCCAACTTTAGGTGTTTTTGCTTCTGCTTATACAGGTCAAGTTGAAAAAAACACTTCTATTTTTATTAAAAATGAATTCACTTTCTATGACGAAGATGGAAAACCAATTAATTTTGATAATGCCCTTCTCTCAGTAGCTTCTCTTAACCGTGAACATAACTCTATTGAGATGGCTAAAGATTATAGTGGTAAATTTGTCAAAATCTCTGGTTCATCTATTGGTGAAAAGAATGGCATGATTTATGCTACAGATACTCTTAACTTTAAACAGGGTGAAGGTGGCTCTCGCTGGACTATGTATAAAAATAGTCAAGCTGGTTCAGGATGGGATAGTTCAGATGCGCCGAATTCTTGGTATGGAGCAGGGGCTATTAAAATGTCTGGTCCGAATAACCATGTTACTGTAGGAGCAACTTCTGCAACAAATGTAATGCCAGTTTCTGACATGCCTGTTGTTCCTGGTAAGGACAATACTGATGGCAAAAAACCAAATATTTGGTATTCTTTAAATGGTAAAATCCGTGCGGTTAATGTTCCTAAAGTTACTAAGGAAAAACCCACACCTCCGGTTAAACCAACAGCTCCAACTAAACCAACTTATGAAACAGAAAAGCCATTAAAACCGGCACCAGTAGCTCCAAATTATGAAAAGGAGCCAACACCGCCGACAAGGACACCGGATCAAGCAGAGCCAAACAAACCCACACCGCCGACCTATGAAACAGAAAAGCCGTTGGAGCCAGCACCTGTTGAGCCAAGCTATGAAGCAGAGCCAACACCGCCGACAAGGACACCGGATCAGGCAGAGCCAAATAAACCCACACCGCCGACCTATGAAACAGAAAAGCCGTTGGAGCCAGCACCTGTTGAGCCAAGCTATGAAGCAGAGCCAACGCCACCGACACCAACACCAGATCAACCAGAACCAAACAAACCTGTTGAGCCAACTTATGAGTAAGTCGACCCCGGGCGGCCGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCGATAAGGATCCGGGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGAGCTTTACGGCACCTCGACCGCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAATATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAAC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5.权利要求1所述的免疫防龋DNA疫苗在鼻粘膜、胃肠道粘膜以及生殖道粘膜中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种免疫防龋DNA疫苗及制备方法和应用，大肠杆菌(Escherichia coli)JM109/pCIA－P CCTCCNOM201041。采用PCR技术从携带有PAc编码基因pac的质粒pPC41扩增出重要抗原决定簇区A区和P区片段，并克隆到pGEM－T载体中，将筛选后的阳性重组质粒与真核表达质粒pCI定向克隆成防龋DNA疫苗pCIA－P，并经DNA序列分析鉴定证实构建的正确性，动物实验证明可有效防龋。本发明方法简单，生产成本低廉，安全性高，免疫应答持久，该疫苗在鼻粘膜、胃肠道粘膜中的应用，还可用于龋病易感人群的龋病防治。
文档编号A61P1/02GK1419937SQ0113369
公开日2003年5月28日 申请日期2001年11月21日 优先权日2001年11月21日
发明者樊明文, 边专, 彭志翔, 郭继华, 贾荣, 陈智, 彭彬, 范兵 申请人:武汉大学