调控调节性t细胞功能的方法和组合物的制作方法
【专利说明】调控调节性T细胞功能的方法和组合物 发明领域
[0001] 本发明涉及免疫学，具体涉及增强机体免疫反应的方法，更具体地说是涉及逆转 调节性Τ细胞对机体免疫反应抑制的方法。 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求申请日为2013年3月14日、专利申请号为61/781，024的美国临时专 利申请的优先权，该专利申请内容通过参考并入本申请中。 发明背景
[0003] 通过调控免疫系统来消除传染物、恶性肿瘤细胞等是一个很有前景的治疗方法。 直到最近这种治疗方法在肿瘤免疫上的应用也仅仅有零星的成功案例（DiLorenzoet al.，2011;Lesterhuisetal.，2011;Rosenberg，2011)。最近FDA批准通过了免疫治疗性 疫苗/药物sipuleucel-T(Provenge)和ipilimumab(Yervoy)代表肿瘤免疫治疗领域里程 碑式的成就（Hodietal.，2010;Kantoffetal.，2010)。此外，应用gplOO肽治疗黑色素 瘤的三期临床试验取得了很好的临床效果（Schwartzentruberetal.，2011)。然而，这些 药物的临床效果远远没有达到完全有效和永久治愈的程度。对于sipuleucel-T，病人使用 后也只延长4. 1个月的存活期，没有明显的肿瘤消退及PSA水平的变化；而每个病人的花费 却高达93, 000美元。因此，急需要为癌症患者，包括转移性前列腺癌患者，开发一种更为有 效和平价的疫苗/药物。
[0004] 多种因素可造成肽为基础的疫苗，包括FDA批准的疫苗临床效果差的原因 (Buonerbaetal.，2011)，其中，强有力的负调控机制，包括肿瘤微环境中调节性T细胞 (Treg)介导的免疫抑制，是改善肿瘤疫苗和药物疗效的主要障碍Curieletal.，2004; Wangetal·，2004;WangandWang，2007 ;Zou，2006)。例如，原先就存在于肿瘤病灶位置 的CD4+调节性T细胞（Treg)，可以潜在地抑制抗肿瘤免疫反应，从而成为肿瘤免疫治疗 的主要障碍（Wangetal.，2004;Wangetal.，2005;WrzesinskiandRestifo,2005)〇 ⑶4+Treg介导的肿瘤免疫抑制在肿瘤动物模型和肿瘤患者中都有报道（Berendtand North，1980;Mukherjietal.，1989)，在不同种类肿瘤的患者，包括肺癌，乳腺癌及卵巢癌 患者，其CD4+CD25+Treg细胞在全部CD4+T细胞中所占的比例升高（Curieletal.，2004; Wooetal.，2001)。我们的研究进一步证明肿瘤病灶中存在抗原特异性⑶4+Treg细胞， 它们可以诱导抗原特异性和局部免疫耐受（Wangetal.，2004;Wangetal.，2005)。因此 克服这些免疫抑制可能是成功开发更有效的肿瘤疫苗和药物的关键。一些研究者试图用 CD25+抗体消除CD4+CD25+Treg细胞（Mahnkeetal.，2007;Morseetal.，2008;Powell etal·，2008;RechandVonderheide，2009)，另有研究者用环磷酰胺去除Treg细胞（Audia etal.，2007;Ghiringhellietal.，2007)。然而，无论是⑶25抗体还是环磷酰胺均不是 特异针对Treg细胞，因为⑶25不仅仅表达在⑶4+⑶25+Treg，还表达在活化的T细胞表面。
[0005] Treg细胞根据其表型、细胞因子表达谱和抑制机制的不同可以分为不同的亚 类。自然发生的⑶4+⑶25+Treg细胞是⑶4+T细胞的一个小亚群，它发源于胸腺，未接触 抗原，通过细胞接触机制抑制免疫反应（Sakaguchi，2004 ;Shevach，2002)。相比之下，抗 原诱导的Treg细胞，例如Trl和Tr3是在外周中经抗原刺激生成，它们通过释放抑制性 的细胞因子IL-lO/TGF-β来抑制免疫反应（Levingsetal.，2002 ;Shevach，2002;von Boehmer，2005)。我们之前的研究表明LAGE1或ARTC1特异的CD4+Treg细胞与自然发生 的⑶4+⑶25+Treg细胞一样，依赖于细胞接触机制抑制免疫反应（Wangetal.，2004;Wang etal.，2005)。CD4+CD25+Treg细胞和LAGE1特异的Treg细胞的抑制功能在DCs不存在 的条件下可以被TLR8配体如多聚鸟苷核苷酸（PolyG-OND)逆转（Pengetal.，2005)。因 为CD4+Treg细胞富集在肿瘤部位，我们推测，Treg细胞的不同亚类可能存在于肿瘤病人的 肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs)中。我们在研究验证这一推测时发现了一个新型抗原特异性 ⑶4+Treg细胞亚群，它的免疫抑制作用是通过释放不同于IL-10或TGF-β(或二者都有） 的可溶性因子。
[0006]尽管用PolyG-OND处理可以逆转Treg细胞功能（Kiniwaetal·，2007;Penget al·，2005;Pengetal·，2007)，但是还不确定PolyG-OND是否可以逆转人和小鼠Treg细胞 的抑制功能。
[0007] 急需一种方法和治疗试剂可用来操控Treg细胞的免疫抑制能力。
【发明内容】
[0008] 这里描述的是产生一种新型的⑶4+Treg细胞，它抑制免疫反应是通过IL-10或 TGF-β非依赖性的可溶性因子介导的。为克服免疫抑制及去除免疫抑制细胞所引起的潜 在问题，本发明利用新鉴定的Treg细胞开发了一种筛选系统用于筛选、鉴定能够阻断Treg 细胞抑制功能的化合物。分别用新鉴定的化合物处理Treg细胞不同的时间，可以得到维持 Treg细胞处于非抑制状态的不同时间窗口期。由于小鼠的TLR8没有功能，我们制备了人 TLR8转基因小鼠，研究发现，用本发明抑制Treg细胞功能的化合物分别处理人TLR8转基 因小鼠及C57BL/6野生型小鼠，人TLR8转基因小鼠而不是野生型小鼠的抗肿瘤免疫反应增 强。
[0009] 宿主免疫反应中的Treg细胞抑制剂可以增强机体免疫反应，可用于在病人的免 疫系统需要增强的情况下，如针对肿瘤或感染性疾病时，使用。
[0010] 抑制或增强宿主免疫反应中的Treg细胞功能的化合物、包含化合物的药物组合 物包括但不局限于表1所列出的代表性化合物号为1，2, 34, 5,6, 7,13, 22, 23, 24和25的化 合物。
[0011] 因此，一个实施方案中，本发明提供了一个药物组合物，其中含有达到药学有效量 的、来源于表1所列化合物号为1，2,34,5,6,7，13,22,23,24和25中的一个化合物，以及符 合药学规范的赋形剂。本发明中的药物组合物可进一步包含一个抗原，这个抗原可能蛋白， 多核苷酸或多糖抗原。在一个实施方案中，本发明的药物组合物还可进一步包含一个佐剂。
[0012] 在另一个实施方案中，本发明在哺乳动物需要时提供了一种抑制Treg细胞介导 的免疫抑制的方法，或更通俗地说是增强机体免疫反应的方法，此方法是给哺乳动物用一 个有效药物剂量的、激活MyD88-IRAK4信号通路的一个Toll样受体8配体的药物组合物。 所述配体选自ssRNA40,ssRNA33,CpG，Poly-G10,resiquimod，loxoribine，鞭毛蛋白，LPS， Pam3CSK4 ;或从化合物号为1，2, 34, 5,6, 7,13, 22, 23, 24和25的组中选取。
[0013] 在一个实施方案中，哺乳动物是人。哺乳动物可能患有癌症或者是具有患癌症的 风险。可进一步给予哺乳动物致免疫量的、含有癌症特异性抗原的癌症疫苗。在另一个实 施方案中，进一步给予哺乳动物佐剂。佐剂可与抗原一起或偶联到抗原上给药。
[0014] 在另一个实施方案中，有效剂量的化疗药物也可给予哺乳动物。
[0015] 哺乳动能可能患感染性疾病或有得感染性疾病的风险。
[0016] 本发明进一步提供了筛选抑制宿主免疫反应的Treg细胞抑制剂的方法，包括1) 提供一个候选化合物，2)提供CD4+Treg细胞，3)分别在候选化合物存在及不存在的条件 下，将初始型CD4+T细胞与CD4+Treg细胞共培养，4)分别在候选化合物存在及不存在的条 件下，检测初始型CD4+T细胞的生长速率，5)比较在候选化合物存在与否的条件下CD4+T细 胞的生长速率，如果化合物存在的条件下CD4+T细胞的生长速率比化合物不存在时要高， 说明此化合物可以逆转CD4+Treg免疫抑制功能，可以作为CD4+Treg的抑制剂。CD4+Treg 细胞表达CD25,GITR和FoxP3,释放IL-10,可以抑制机体的免疫反应。CD4+Treg细胞也可 对某种抗原有特异性。在一个实施方案中，本发明的一种筛选方法包括将CD4+T细胞与抗 原呈递细胞（APCs)，如呈递特异抗原的DCs共培养。⑶4+Treg细胞的生长速率可以通过掺 入⑶4+T细胞的[3H]-胸苷来检测。
[0017] 提供本发明所述的化合物或者药物组合物，单独使用或联合其他治疗剂，例如抗 原制剂或疫苗的方法治疗所需病人（例如对于癌症病人或患有感染性疾病的病人）。 附图简要说明
[0018] 图1.肿瘤反应性⑶4+⑶25+T细胞系或克隆的产生和表征。（A)用流式细胞仪分析 ⑶4+⑶25+T细胞在患者初始型⑶4+T细胞或其TIL108中的情况。（B)自TIL108来源的细 胞中分析抗原特异性T细胞克隆。测试T细胞克隆对一系列肿瘤靶标及表达HLA-DR1，DR4 或DR7 分子的 293T细胞的反应。586mel，1363mel，1558melandl64mel表达HLA-DR1 分子， 而108meland1359mel分别为HLA-DR7和-DR4阳性。T细胞释放的GM-CSF通过ELISA检 测。
[0019] 图2.细胞因子表达谱及流式细胞仪分析CD4+T细胞的结果。（A)T细胞克隆的细 胞因子表达谱。（B)FACS分析T细胞克隆。用藻红蛋白（PE)或FITC标记的单克隆抗体靶 向⑶4,⑶25和GITR分子。同型对照抗体作为阴性对照。（C)实时定量PCR检测TIL108T 细胞中Foxp3的表达水平。TIL1363-Th细胞作为对照。HPRP作为内参。
[0020] 图3.TIL108Treg细胞抑制免疫反应的功能特征。（A)TIL108CD4+Treg克隆的免 疫抑制活性。所有的TIL108Treg克隆抑制初始型⑶4+T细胞的增值，而⑶4+效应1363-Th 细胞增强初始型CD4+T细胞的增值。（B)免疫抑制不依赖于细胞接触机制。通过transwell 系统将初始型⑶4+T和Treg细胞克隆分开