水稻细胞周期蛋白OsCYCP4；4的应用及提高水稻耐低磷胁迫的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种水稻细胞周期蛋白0SCYCP4; 4 的应用及提高水稻耐低磷胁迫的方法。
【背景技术】
[0002]磷是一切生命所必需的大量元素之一。磷元素不仅构成了细胞内包括DNA，RNA， ATP和磷脂等在内的重要大分子，而且还参与调节信号转导，能量代谢和光合作用等重要的 生理生化过程（Abel S(2011)Phosphate sensing in root development.Curr Opin Plant Biol 14:303-309)。随着分子生物学研究水平的不断提高，我们对植物体磷吸收和 体内代谢的复杂生理生化过程有了一定的了解。植物中参与响应低磷胁迫的基因不断被发 现，这些基因包括编码受磷饥饿诱导的可使植物特异性高效吸收和利用磷的磷酸盐转运体 和磷酸酶，而其他基因编码的转录因子参与调控这些磷饥饿诱导基因的表达(Wu P(2014) SPX4Negatively Regulates Phosphate Signaling and Homeostasis through Its Interaction with PHR2in Rice.Plant Cell 26:1586_1597;Zhou J，Jiao F，Wu Z，Li Y， Wang X,He X,Zhong ff,ffu P(2008)0sPHR2is involved in phosphate-starvation signaling and excessive phosphate accumulation in shoots of plants. Plant Physiol 146:1673-1686;Zhang Z,Liao H，Lucas WJ(2014)Molecular mechanisms underlying phosphate sensing, signaling,and adaptation in plants .J Integr Plant Biol 56:192-220)。
[0003] 缺磷抑制作物地上部分生长，进而严重影响作物产量。但是到目前为止对于磷饥 饿胁迫如何抑制植物生长的分子机制还不是很清楚。已有研究报道植物生长抑制不是由植 物体内磷含量低直接造成的，而是由一系列受磷饥饿触发的基因调控网络协调后的结果 (Rouached H,Stefanovic A,Secco D,Bulak AA,Gout E,Bligny R,Poirier Y(2011) Uncoupling phosphate deficiency from its major effects on growth and transcriptome via PHOlexpression in Arabidopsis .Plant J 65:557-570) 〇 因此，石开究 磷饥饿抑制植物地上部分生长的机理对培育磷高效利用作物非常重要。
[0004] 细胞周期蛋白复合体PH080/PH085是酵母磷信号转导（ΡΗ0,Phosphate Signal Transduct ion)通路中转录因子PH04的重要负调控因子(Gil liquet V，Legrain M，Berben G,Hilger F(1990)Negative regulatory elements of the Saccharomyces cerevisiae ΡΗ0 system:interaction between PH080and PH085proteins.Gene 96:181-188)，同时参 与调控酵母细胞周期中GO期的起始(Wanke V，Pedruzzi I，Cameroni E，Dubouloz F，De Virgilio C(2005)Regulation of GOentry by the Pho8〇-Pho85cyc1in-CDK complex.EMBO J 24:4271-4278)dPH080同源蛋白在拟南芥和水稻中各存在7个，被命名为 一个植物细胞周期家族新成员P类型cyclin蛋白（CYCP) Jorres实验室通过互补实验发现， AtCYCP4;2可以部分恢复酵母ph〇80突变体中的磷信号；酵母双杂交实验显示AtCYCP与 ⑶KA;1互作;但悬浮细胞中AtCYCPs的转录水平不受培养液磷浓度的影响（Torres AJ，de Almeida EJ,Raes J,Magyar Z,De Groodt R,Inze D,De Veylder L(2004)Molecular characterization of Arabidopsis PH080_like proteins,a novel class of CDKA；1-interacting cyclins. Cell Mol Life Sci 61:1485-1497)。但到目前为止没有发现拟南 芥中CYCP家族与磷饥饿信号响应的联系。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种水稻细胞周期蛋白0sCYCP4;4的应用，水稻细胞周期 蛋白0sCYCP4;4负调控水稻生长。0sCYCP4;4功能缺失突变体降低低磷抑制地上部生长的敏 感性。
[0006] 本发明还提供了一种提高水稻耐低磷胁迫的方法，通过将水稻细胞周期基因 0sCYCP4;4从目的水稻上敲除，得到的转基因水稻在低磷状态下耐受性更高，为提高植物对 低磷耐受性和培育适用于磷贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 一种水稻细胞周期蛋白0sCYCP4;4在调控低磷胁迫下水稻生长的应用。
[0009] 作为优选，水稻细胞周期蛋白0sCYCP4;4的氨基酸序列见SEQ ID N0.1所示。
[0010]作为优选，水稻细胞周期蛋白〇sCYCP4; 4负调控水稻生长。
[0011] -种编码水稻细胞周期蛋白0sCYCP4;4的基因，该基因为水稻细胞周期基因 0SCYCP4;4，水稻细胞周期基因0 SCYCP4;4的核苷酸序列见SEQIDN0.2所示。
[0012] 发明人经过长期研究，首次发现低磷胁迫下与水稻生长调控直接相关的因子-水 稻细胞周期蛋白0sCYCP4; 4，水稻细胞周期基因0sCYCP4; 4的表达在转录水平和翻译水平上 均受磷饥饿胁迫的诱导。过量表达0sCYCP4;4基因抑制水稻生长，证明其负调控水稻生长。 在正常培养条件下，0sCYCP4;4功能缺失突变体与野生型相比没有明显的表型差异，但突变 体磷含量明显高于野生型。在缺磷条件下，0sCYCP4;4功能缺失突变体降低低磷抑制地上部 生长的敏感性。利用发现的水稻细胞周期蛋白0sCYCP4;4在低磷胁迫下负调控水稻生长的 特点，为提高植物对低磷耐受性和培育适用于磷贫瘠土壤的水稻新品种提供了保障。
[0013] 一种提高水稻耐低磷胁迫的方法，通过将水稻细胞周期蛋白0sCYCP4; 4的编码基 因水稻细胞周期基因0sCYCP4; 4从目的水稻上敲除，使得水稻耐低磷胁迫能力提高。水稻细 胞周期基因0sCYCP4; 4缺失后能提高植株磷含量，且降低植株对低磷抑制生长的敏感性。
[0014] 作为优选，将水稻细胞周期蛋白0sCYCP4; 4的编码基因水稻细胞周期基因 0sCYCP4; 4从目的水稻上敲除的方法为:采用农杆菌介导法将载体转入目的水稻的愈伤组 织中，培养获得0sCYCP4; 4基因敲除的突变体。
[0015]作为优选，水稻细胞周期基因0sCYCP4;4缺失后提高了水稻植株磷含量，且降低水 稻植株对低磷抑制生长的敏感性。
[0016] 作为优选，水稻细胞周期基因0SCYCP4;4的核苷酸序列见SEQIDN0.2所示。
[0017] 作为优选，所述载体为 pYLCRISPR/Cas9-MH-0sCYCP4; 4。
[0018] 本发明的有益效果是:通过将水稻细胞周期基因0sCYCP4;4从目的水稻上敲除，得 到的转基因水稻在低磷状态下耐受性更高，为提高植物对低磷耐受性和培育适用于磷贫瘠 土壤的水稻新品种提供了保障。
【附图说明】
[0019]图l:0sCYCP4;4(水稻细胞周期基因）对低磷胁迫的响应。A，水稻正常供磷(200μΜ， HP)和低磷（1 ΟμΜ，LP)处理21天后地上（shoo t)和地下（roo t)部分0sCYCP4; 4基因表达水平 的实时定量PCR检测结果;B，0sCYCP4; 4基因组融合GUS的转基因植株在正常供磷（200μΜ， HP)和低磷（10yM，LP)处理21天后地上(shoot)和地下(root)部分⑶S染色结果。
[0020] 图2: 0SCYCP4; 4过表达转基因水稻的表型观察。A，7天苗表型;B，A中苗根(root)和 地上部分（shoot)长度统计。苗数15颗。野生型：SSBM;0sCYCP4;4过表达植株：0sCYCP4; 40VER-5，0sCYCP4;40VER-9和0sCYCP4;40VER-10。
[0021 ] 图3:突变体cycp4;4的磷含量:A，地上（shoot)和地下(root)部分无机磷含量;B， 地上(shoot)和地下(root)部分总磷含量。
[0022] 图4:突变体cycp4; 4在低磷下的响应。A:突变体cycp4; 4在正常供磷(200μΜ，HP)和 低磷（10yM，LP)处理21天的表型观察;B，A中植株地上（shoot)和地下(root)部分长度的测 量和统计;C，A中植株地上(shoot)和地下(root)部分相对干重的称量和统计。
【具体实施方式】
[0023]下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。 [0024]本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0025] 实施例：
[0026] 一种提高水稻耐低磷胁迫的方法，通过将水稻细胞周期蛋白0sCYCP4; 4的编码基 因水稻细胞周期基因0sCYCP4;4从目的水稻上敲除（具体步骤见试验部分第4节），使得水稻 耐低憐胁迫能力提尚。
[0027]试验：
[0028] 1、0sCYCP4;4在转录水平对低磷胁迫的响应
[0029]野生型水稻正常供磷（200μΜ)和低磷（10μΜ)条件下液体培养21天，分别提取地上 和地下部分RNA样品，逆转录后进行实时定量PCR。结果显示0sCYCP4;4基因在地上和地下部 分的表达均受低磷胁迫诱导（图1A); 0sCYCP4; 4实时定量PCR引物：
[0030] P1:5'GCAGCACTCAGCATCAGTTAGC 3'（SEQ ID N0.4)
[0031] P2:5'TGTGCTAGGAGCAAATGCTTTG 3'（SEQ ID N0.5)。
[0032] 2、0sCYCP4;4在翻译水平对低磷胁迫的响应
[0033] 根据NCBI网站提供的水稻基因组全序列，我们克隆了0sCYCP4;4的全长基因组序 列SEQ ID N0.2，包括3000bp启动子，5 '非翻译区，外显子和内含子。设计带有BamH和ΚρηΙ酶 切位点和保护碱基的扩增引物：
[0034] Ρ3：5；CGCGGATCCCAGTTGCAAGTCCAAGCAAA 3'（SEQ ID Ν0.6)，
[0035] P4：
[0036] 5'CGGGGTACCCGCAGCTAACTGATGCTGA 3'（SEQ ID NO.7)。
[0037] 提取水稻基因组DNA，取50ng DNA作为模板在50μ1体系中进行目的片段的扩增。扩 增体系为：DNA模板ΙμL，引物Ρ3( 10μΜ)0.2μ1，引物Ρ4( 10μΜ)0.2μ1，2 X K0D缓冲液（购自 TOYOBO公司）25μ1，dNTP (2.5mM) 2μ1，KOD酶(购自 TOYOBO公司）2μ1 加水至50μ1。扩增条件为： 94°C预变性5min，然后以94°C变性lmin，62°C复性lmin，72°C延伸4min，进行28个循环，最后 72°C延伸lOmin。通过凝胶电泳回收扩增片段，通过酶切连接将目的片段融合入由 PCAMBIA1300改造而来pCAMBIA1300-GUS(在pCAMBIA1300后面加入⑶S序列和终止子Nos)载 体中，转化大肠杆菌感受态细胞，挑选阳性克隆后进行测序获得重组克隆P QsCYCP4; 4: