专利名称：SIRT1在制备下调细胞周期蛋白如cyclin D1表达的药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及SIRTl在制备调控细胞周期蛋白表达的药物中的用途，特别地，本 发明涉及SIRTl在制备下调cyclin DU cyclin E或CDK2表达的药物中的用途。
背景技术：
新生内膜形成与血管重塑密切相关，主要包括血管平滑肌细胞的增殖、迁移、 凋亡以及基质成分合成、降解及重新排列等过程。过度的血管平滑肌细胞增殖是动脉粥 样硬化、肺动脉高压、系统性高血压、腹主动脉瘤及经皮腔内血管成形术后再狭窄等心 血管疾病的重要病理基础。细胞增殖正常与否与细胞周期密切相关。细胞周期分为Gl期(DNA合成准备 期)、S期(DNA合成期)、G2期(有丝分裂准备期)和M期(有丝分裂期)。在哺乳动 物的整个细胞周期调控中，Gl —S期的调控是至关重要的核心过程，它决定细胞对外界 增殖信号如各种生长因子等的加工、反应，决定细胞是进入有丝分裂，还是发生凋亡抑 或进入静止期GO期，修复损伤DNA (Hunter and Pines. 1994)。细胞增殖主要通过以下三 种蛋白进行调控周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependentkinase，CDK)，周期蛋白 (Cyclin)，周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor, CKI)。 细胞周期的Gl到S期转换受到多种Cyclin-CDK复合物的正性调控，同时受到CKI两 个亚家族INK4和Cip/Kip的负性调控。在周期蛋白中cyclin Dl在细胞周期中最早被合 成，于Gl中期到达高峰，并与CDK4/CDK6形成复合物，对决定G1/S期转换的限制点 进行调控。其中cyclin D1/CDK4和cyclin E/CDK2两个复合物是极其重要的G1/S转换 禾口 DNA 合成的决定因素(Baldin，Lukas et al. 1993 ； Quelle, Ashmun et al. 1993 ； Tsai, Lees et al.1993 ； Ohtsubo, Theodoras et al.1995)。有活性的 cyclin D-CDK4/CDK6 复合 物可以磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma，Rb)，从而释放E2F，促进细胞周期 进行。CydinE/CDK2复合物在Gl期中、晚期合成增加，加速细胞进入S期，并促使 DNA合成。在许多细胞体系里，生长因子刺激后cyclin Dl比cyclin E更早被诱导表达升 高。因此，cyclin Dl相关的激酶远比cyclin E相关的激酶更早被大量激活(Sherr.1993)。 CDK4主要与cyclin Dl形成复合物，而CDK2 (NCBI登录号NM 001798)则结合cyclin E 和cyclinA形成复合物。另外，cyclin Dl表达也先于CDK4的激活，同时CDK4蛋白水平 也在 PDGF 刺激后显著升高(Koyama，Nishizawa et al. 1996 ； Koyama, Raine et al. 1996 ； Rao. 1999 ； Kronemann, Nockher et al. 1999)。在上述细胞周期调控中起到重要作用的人cyclin Dl基因(NCBI登录号 NM_053056.2)于1991年在甲状旁腺腺瘤中被克隆发现，它位于11号染色体长臂1区三带 (llql3)，包含5个外显子。cyclin Dl最初是被作为集落刺激因子激活的早期反应基因从 小鼠骨髓巨噬细胞中分离获得(Matsushime，Roussel et al.1991)，目前对cyclin Dl的调控 主要见于对其转录水平及其蛋白通过泛素化途径降解的研究(Diehl，Zindy et al.1997)。cyclin Dl基因启动子区域含有多个顺式反应元件，其中包括AP_1 (activator protein-1)， NF- κ B (nuclear factor- κ B)，SPl 以及激活转录因子 ATF (activating transcription factor) / cAMP 反应元件结合蛋白 CREB (cAMP-responsive element-binding protein)等(Schneider, Oswald et al.2002)。cyclin Dl作为细胞周期调节因子之一，在正常人体组织中呈低水平表 达，当cyclin Dl表达失控时，将引起细胞增殖周期失调，导致恶性肿瘤发生。目前cyclin Dl已经被确认为一个癌基因，其过度表达是多种人类原发性肿瘤(如甲状旁腺腺瘤，乳 腺癌，结肠癌，淋巴瘤，黑素瘤以及前列腺癌等)的特征，对肿瘤的诊断及预后具有重 要意义。cyclin Dl的转基因和缺失鼠的研究结果进一步明确了其与肿瘤发生发展的相关 性。cyclin Dl过表达拮抗很多因素引起的肿瘤细胞生长抑制。cyclin Dl转基因鼠自发形 成肝癌，并且反义cyclin Dl能抑制其肝癌生长(Deane NG et al.2001 ； Uto H et al.2001)。 同时cyclin Dl转基因鼠乳房过增生，并且易罹患乳腺癌(Wang et al.1994)。当同时敲除 cyclin DU D2和D3后，对小鼠胚胎正常的组织发育几乎没有什么影响，但在缺乏cyclin D的胚胎细胞中诱导肿瘤转化，该细胞仍然正常，这说明抑制过度活跃的cyclin D可能阻 断癌症细胞增殖(Kozar K et al.2004)。实验证明，瘤细胞中注射cyclin Dl抗体、反义寡 核苷酸或导入反义cyclin Dl重组质粒，可一定程度抑制Gl — S期过渡，改变或逆转细胞 恶性表型(Reed JC et al.1999)。近年来研究发现cyclin Dl还可以调控细胞代谢，脂肪细 胞分化，并且可以作为细胞衰老的标志。Cyclin E基因(NCBI登录号NM_57182.1)定位于人染色体19ql2 13，由4个 外显子和3个内含子组成，编码395个氨基酸，蛋白分子量为50KD。cyclin E不仅参与 细胞周期G1/S的正性调控，其过表达可以直接激活CDK2，从而造成肿瘤细胞的异常增 殖。另外也可能导致肿瘤细胞对内分泌治疗产生耐受性(Harwell RM et al.2004 ； Span PN et al.2003)。cyclin E在很多肿瘤中的表达在质和量上都有异常。乳腺癌中cyclin E的增 加不仅与肿瘤组织分级和临床分期有关，而且与不良预后和较高死亡率有关。目前，现有技术中记载人类SIRTl(SIRTuin 1，NCBI登录号为ΝΜ_012238) 是NAD+依赖的III类组蛋白去乙酰化酶，SIRTl基因位于人10号染色体，编码747个 氨基酸残基的蛋白质，其在各物种之间呈现高度的保守性，在7个SIRT成员中与酵母 Sir2 (silence information regulator2)的同源性最高。近年来的研究发现，SIRTl能够去乙 酰化组蛋白(H3，H4)和多种转录因子和转录辅助因子，包括MyoD、p300、PGC-1 α、 PPAR γ > NF-κ B、Ku70、p53、FOXO> E2F1等，在胚胎发育、组织分化、代谢调节、 细胞凋亡、DNA损伤修复，抵抗应激，细胞衰老以及肿瘤发展等方面发挥重要的作用。鉴于细胞周期蛋白如cyclin Dl在调控细胞增殖中具有重要的作用，而细胞的过 度增殖与众多心血管疾病及肿瘤密切相关，因此，如果能找到能有效调控cyclin Dl及相 关细胞周期蛋白的表达，特别是下调cyclinDl及相关细胞周期蛋白表达的作用因子，那么 将对与细胞过度增殖导致的众多心血管疾病及肿瘤的治疗具有巨大的治疗潜力。同时，如 前所述，SIRTl作为NAD+依赖的III类组蛋白去乙酰化酶，在很多方面发挥重要的作用。 然而，现有研究尚未涉及SIRTl在cyclinDl及相关细胞周期蛋白调控中的作用情况。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是探究SIRTl在cyclin Dl及相关细胞周期蛋白表达调控中的作用并探究SIRTl在心血管疾病治疗中的应用前景。因此，本发明 提供了 SIRTl在制备下调哺乳动物包括人的细胞周期蛋白表达的 药物中的用途，特别地，所述细胞周期蛋白是cyclinDl、cyclin E或CDK2。特别地，所 述药物是提纯的蛋白质类型的药物，其剂型可以是适于蛋白质药物应用的任何剂型，如 注射剂。特别地，所述药物是能表达SIRTI蛋白的重组核酸构建体，其表达载体可以是 任何适用于基因治疗用的表达载体，包括常用的病毒载体或非病毒载体，所述表达载体 选自重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或牛痘苗 病毒载体，所述非表达载体选自噬菌体载体或复制子载体。由于cyclin Dl的过表达与新生内膜形成异常密切相关，而新生内膜形成异常是 动脉粥样硬化等心血管疾病的重要病理基础，因此，上述基于SIRTl的下调cyclin Dl及 cyclin E表达的药物可以进而抑制新生内膜形成并可预防和/或治疗由于新生内膜形成异 常导致的心血管疾病。具体而言，本发明通过具体的实验证明，SIRTl抑制了血清刺激及小鼠颈总动 脉结扎引起的细胞周期蛋白cyclin Dl表达增高，使血管平滑肌细胞(VSMCs)阻滞在Gl 期，抑制VSMCs增殖和小鼠颈总动脉结扎引起的细胞增殖，进而抑制新生内膜形成。细言之，发明人首先通过3H_TdR、流式细胞术检测SIRTl在体外对细胞增殖和 细胞周期的影响。随后，通过Western blot、RT-PCR观察在基础水平和血清诱导下， 过表达和干扰SIRTl对细胞周期蛋白表达水平的影响；用荧光素酶报告系统检测过表达 SIRTl对细胞周期蛋白cyclin Dl活性的影响。为验证体内水平SIRTl对小鼠颈总动脉结扎 引起的细胞周期蛋白cyclin Dl表达增高的下调作用，构建了平滑肌特异性SIRTl转基因 鼠，应用RT-PCR、Southern blot、Western blot、免疫组化等方法对平滑肌特异性SIRTl 转基因鼠进行鉴定，用Western blot和免疫组化方法观察在小鼠颈总动脉结扎情况下，体 内过表达SIRTl对细胞周期蛋白cyclin Dl表达的影响，并进一步应用小鼠颈总动脉结扎 模型，采用HE染色、免疫组化、Masson染色等方法观察转基因鼠新生内膜形成、血管 平滑肌细胞增殖和细胞外基质(ECM)。本发明发现，腺病毒介导的SIRTl过表达可以抑制基础水平和血清诱导的原代 血管平滑肌细胞增殖，并使血清诱导的原代血管平滑肌细胞阻滞在Gl期。SIRTl在体内 外抑制Gl期开关分子cyclin Dl的表达，SIRTl转基因鼠可以抑制由颈总动脉结扎所引起 的新生内膜形成，并且可以减少细胞外基质。即，本发明发现，SIRTl在体内外可以降低cyclin Dl的表达，并可能由此使血
管平滑肌细胞阻滞在Gl期，抑制细胞增殖和新生内膜形成。因此，SIRTl是调控平滑肌 细胞增殖的重要基因，提高SIRTl的表达可以作为抑制血管平滑肌细胞增殖和新生内膜 形成及影响血管重塑过程的一个新手段。在实验中也发现，10% FBS刺激血清饥饿48小时后，已处于静止期的VSMC、 cyclin D1、cyclin E 及 CDK2 均表达增高，而当过表达 SIRT1 时，cyclin D1、cyclin E 及 CDK2的蛋白表达与对照组相比均降低。为排除腺病毒的干扰，在大鼠平滑肌细胞系AlO 中通过转染p3.1SIRTl及pcDNA3.1对照，也同样发现过表达SIRTl能下调cyclin DU cyclin E及CDK2的蛋白表达水平。反之，当RNAi干扰SIRTl近50 %时，发现cyclin Dl的蛋白表达水平升高，而干扰SIRTl后，cyclin E及CDK2蛋白表达水平变化不明显。同时进一步在颈总动脉结扎模型中发现，与相同处理的野生型鼠相比，结扎28天后的 SIRTl转基因鼠颈总动脉中cyclin Dl蛋白水平明显降低(ρ < 0.05)。考虑到cyclin Dl作 为调控Gl期的早期变化基因，同时根据上述结果，在Gl期相关周期蛋白及周期蛋白依 赖性蛋白激酶中，SIRTl对cyclin Dl具有更为明显的调控作用，同时SIRTl过表达在体 外和体内均能降低cyclin Dl的蛋白水平，因此进一步研究了 SIRTl能否在转录水平上对 cyclin Dl进行调控。现有研究证明，SIRTl能与AP-I的两个亚基c-Fos/c-Jun相互作用并确定了 其相互作用的确切的结构域，并且明确了 SIRTl通过去乙酰化及抑制c-Fos/c-Jun的 DNA结合能力来抑制AP-I的转录活性。研究发现，SIRTl过表达不仅能降低由血清 诱导的cyclin D ImRNA水平的增高，同时SIRT1还能显著降低大鼠cyclin D1 (NCBI登 录号NM_171992)启动子活性，由c-Fos/c-Jun诱导升高的cyclin Dl启动子活性也同 样被SIRTl所抑制。为进一步考察SIRTl能否通过c-Fos/c-Jun实现对cyclin Dl转录 水平的调控，分别对包含有AP-I结合位点的大鼠cyclin Dl启动子进行删除和突变， 结果发现当删除-818-814AP-1结合位点后，cyclin Dl启动子活性降低0.85倍，但 SIRTl对大鼠cyclin Dl启动子活性的抑制效应依然存在(降低0.4倍)；而进一步删除包 括-44—41AP-1结合位点后，cyclin Dl启动子活性也降低0.94倍，而SIRTl对大鼠cyclin Dl启动子活性的抑制效应几乎消失(降低0.1倍)；进一步对-44-41AP-1结合位点进 行突变后，发现cyclin Dl启动子活性仍有大幅降低，为0.79倍，而SIRTl对大鼠cyclin Dl启动子活性的抑制效应也有明显降低(降低0.19倍)。因此，这些结果说明AP-I的 结合对cyclin Dl启动子活性的提高起重要作用，同时由于SIRTl对cyclinDl启动子活性 的降低效应可以由-44-41AP-1结合位点的缺失而部分消除，提示-44-41AP-1结合位 点对AP-I参与SIRTl对cyclin Dl的调节中起着关键作用。用ChIP实验也证实SIRTl 和c-Fos/c-Jun可以被募集到cyclin Dl启动子上包含有-44—41AP-1结合位点的同一区 域，并且当RNAi干扰掉SIRTl的表达时，c-Fos/c-Jun在cyclinDl启动子上该区域的募 集增加。因此，上述结果提示SIRTl可能通过与AP-I的相互作用，降低c-Fos/c-Jun在 cyclin Dl启动子上的募集来调节cyclin Dl启动子区的活性。由此可见，本发明通过体内外实验首次证明SIRTl可下调cyclin Dl及相关细胞 周期蛋白如cyclin E和CDK2的表达，由于cyclin Dl及相关细胞周期蛋白如cyclin E和
CDK2可正向调控细胞增殖，因此，SIRTl可以负向调控细胞的增殖作用。因此，蛋白 质SIRTl可以制备为蛋白质类型的药物，或者将SIRTl基因制备为重组表达载体类型的核 酸构建物。在将上述药物给予患者之后，直接提供的SIRTl蛋白或者所述核酸构建物在 患者体内重组表达的SIRTl蛋白能通过下调cyclin Dl及相关细胞周期蛋白如cyclin E和 CDK2的表达，抑制患者体内血管平滑肌细胞过增殖，并进而抑制新生内膜形成并可预防 和/或治疗由于新生内膜形成异常导致的心血管疾病或相关细胞增殖性疾病如肿瘤。
图1 平滑肌特异性转基因鼠SMC-SIRT1 Tg的构建模式图，用平滑肌特异性启 动子SM22 α介导人源SIRTl的表达。图2 Southern blot鉴定获得两株转基因鼠Tgl和Tg2，WT为同窝野生型鼠，Tg为转基因鼠。图3 转基因鼠胸主动脉mRNA水平的过表达，WT为同窝野生型鼠，Tg为转
基因鼠。图4:转基因鼠胸主动脉SIRTl蛋白水平的过表达，WT为同窝野生型鼠，Tg为 转基因鼠，LCCA为左颈总动脉。
图5:免疫组化鉴定SIRTl在转基因鼠中膜平滑肌层的特异性表达，IgG为阴性 对照，WT为同窝野生型鼠，Tg为转基因鼠，标尺为25μΜ。图6: HE染色结果，WT为同窝野生型鼠，Tg为转基因鼠，N代表新生内膜， M代表中膜，标尺为50 μ Μ。图7: SIRTl体内过表达抑制颈总动脉结扎引起的新生内膜形成，新生内膜形成 率用内膜/中膜面积比表示，**代表Ρ<0.01。图8 SIRTl体内过表达抑制由颈总动脉结扎28天引起的细胞增殖，A，SIRTl 体内过表达显著降低PCNA阳性细胞，PCNA阳性细胞为细胞核棕黄色的细胞，标尺为 25μΜ； B，SIRTl体内过表达显著降低颈总动脉结扎28天后的内膜PCNA阳性细胞率， ** 代表 P < 0.01。图9 SIRTl体内过表达抑制由颈总动脉结扎28天引起的血管细胞外基质形成， A，SIRTl体内过表达显著降低胶原纤维形成，胶原纤维为血管内蓝色着色区域，标尺为 50μΜ； B, SIRTl体内过表达显著降低颈总动脉结扎28天后的内膜胶原百分率，**代 表卩< 0.01。图10 SIRTl转基因鼠由颈总动脉结扎引起的内膜中TUNEL阳性细胞数在每 1000个细胞(A)和每10000 μ m2 (B)均与野生型鼠相比无显著差异。图11 SIRTl过表达抑制基础状态及血清刺激12小时后的血管平滑肌细胞DNA 合成，** 代表 P <0.01，*** 代表 P < 0.001。图12 SIRTl过表达在血清刺激12小时后使血管平滑肌细胞阻滞在Gl期，*代 表卩< 0.05。图13: SIRTl过表达在血清刺激12，16，20小时后使大鼠平滑肌细胞系A7r5阻 滞在Gl期，*代表P <0.05。图14 SIRTl过表达下调血清刺激引起的血管平滑肌细胞cyclin Dl，cyclin E, CDK2蛋白水平的增高，*代表P <0.05。图15 SIRTl过表达下调血清刺激引起的大鼠平滑肌细胞系AlO cyclin Dl, cyclin E，CDK2蛋白水平的增高，*代表P < 0.05。图16 RNAi SIRTl干扰后进一步上调血清刺激引起的血管平滑肌细胞cyclin Dl 蛋白水平的增高(A)，而cylinE，CDK2变化不大(B)，*代表P < 0.05。图17 SIRTl体内过表达下调由颈总动脉结扎28天后引起的cyclin Dl蛋白水平 的增高，A，蛋白水平结果；B，免疫组化结果，细胞核棕黄色的为cyclin Dl阳性细胞，
* 代表 P < 0.05。图18 SIRTl过表达下调血清刺激引起的血管平滑肌细胞cyclin Dl mRNA水平 的增高，*代表P <0.05。图19 大鼠cyclin Dl启动子AP_1结合位点及突变位点模式图，也即大鼠cyclinDl报告基因cyclin DHuc序列。图20 SIRTl过表达下调c_Fos和c_Jun引起的cyclin Dl报告基因活性的增高， * 代表 P <0.05，** 代表 P <0.01。图21 AP-I介导了 SIRTl对cyclin Dl报告基因活性的抑制I，*代表P<0.05， ** 代表 P <0.01，*** 代表 P < 0.001。图22 AP-I介导了 SIRTl对cyclin Dl报告基因活性的抑制II，***代表P < 0.001。图23:SIRT1、c_Fos、c_Jun结合在cyclinDl启动子区，上图柱状图为实时定
量PCR结果，下图为普通PCR结果。图24: SIRTl干扰后，c_Fos，c_Jun在cyclin Dl启动子上该区域的募集增加。
具体实施例方式下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在 不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的 范围。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法。实施例实施例1平滑肌特异性人源SIRTl转基因鼠构建1.用于制备转基因的SMC-SIRT1的克隆构建包含5’摆动序列445个碱基对的小鼠SM22 α启动子是一个血管平滑肌细胞特 异表达的启动子，它只在成年大鼠的大动脉及中动脉有活性，而在静脉或内脏平滑肌细 胞，心肌或骨骼肌细胞中均无表达。将含BssH II和BamHI酶切位点的小鼠SM22 α启动子片段与用BamHI和NotI 双酶切的人源野生型SIRTl质粒用T4DNA连接酶连接并克隆入含PolyA的载体中，经 转感受态大肠杆菌细胞，小提质粒单酶切和联合酶切鉴定并送测序，所得结果在网上经 BLAST比对确认克隆的正确并命名为SMC-SIRT1。相关结果见图1。2.显微注射用质粒DNA的制备与纯化将正确的SMC-SIRT1质粒经大量制备后，用BssHII酶切50 μ g质粒DNA，然 后将产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，切取5.5Kb条带回收并溶解于2.4mlTE液中。加入 3克氯化铯充分溶解后经超速离心后从管底分管接取液体经电泳观察，将含有DNA的管 中液体合并，透析后取少量琼脂糖电泳观察质量，紫外分光光度计测定浓度，然后按照 l-3ng/ μ 1的浓度稀释供显微注射。3小鼠的超排卵和取卵选择4-6周龄(体重12-16克)C57BL/6小鼠作为卵供体母鼠，腹腔注射孕马血 清PMS(5U/只鼠)，46-48小时后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素hCG(5U/只鼠)后每只 母鼠同一只种鼠(选用C57BL/6与FVB杂交一代的公鼠，8周龄后(体重25克以上)开 始使用)合笼，次日晨检查精栓，有精栓的小鼠用于取卵。取有精栓之卵供体鼠，引颈 法处死，70%酒精冲洗腹部表皮，剪开腹部皮肤，腹肌 和腹膜，暴露腹腔，沿子宫找到 卵巢及输卵管，夹住子宫，剥离子宫及卵巢系膜，剪断子宫与输卵管连接处；夹住输卵管，剪断卵巢与输卵管连接处，将输卵管置于M2工作液中。以同样操作剪取对侧输卵 管。在解剖显微镜下，以钟表镊撕开输卵管膨大部分的输卵管壁，吸取卵团置于含透明 质酸酶的M2培养基中(透明质酸酶浓度为0.3mg/ml)；显微镜下反复吸吹后将卵转移至 不含透明质酸酶的M2培养基中，重复洗3-4次。将清洗后的单个卵细胞集中置于M16 培养基中，转至37°C二氧化碳孵箱中(5% CO2)培养待注射。4.显微注射 将一大滴M2培养液置于注射室中央，上面覆盖矿物油(Sigma公司)。从CO2 孵箱中转移10-30个卵到注射室M2培养基中，将拉制出的注射针虹吸DNA溶液至尖端 后，接在显微注射器的正压出口处，调整注射时间为50ms，注射压力为40psi，平衡压力 为3-4psi，将注射针在低倍镜监视下插入液滴中；脚踏开关使产生负压，以持卵针开口 对准一个受精卵的中部边缘将受精卵吸牢；换至高倍镜使受精卵原核清晰可见，选择较 大的雄原核，把注射针头部调整至与原核一个平面上，缓慢插入受精卵透明带、胞膜、 胞浆、核膜至核基质中，脚踏微注射器开关，可见核膜明显膨胀，表示DNA溶液已进入 核浆，迅速抽出注射针，观察注射后的受精卵是否有明显损伤，用持卵针将注射后的受 精卵转移至液滴左下部，即完成一次注射。将注射后仍完好的受精卵移至另一 M16培养 液中培养待输卵管转移。显微注射后完好的卵在M16培养基中(5% C02，37°C)，培养 过夜后分裂成两细胞的比例约为60-80%。为避免卵长时间体外培养可能对卵发育产生的 损害，一般将注射当天的单细胞受精卵进行输卵管移卵。5.输卵管移卵注射后当天的单细胞受精卵或培养至第二天的两细胞受精卵均可用于输卵管移 卵。取假孕母鼠称其体重，按0.015ml/g体重给小鼠腹腔注射麻醉剂三溴乙醇(Avertin) 水饱和液，3-7分钟麻醉进入平稳期。将鼠腹侧卧位，70%酒精消毒皮肤，用解剖剪剪开 一个小口，开口处位于脊柱旁侧lcm，约与最后1根肋骨平齐。用镊子沿切口撕开皮肤 肌肉，透过腹膜可见卵巢(桔黄色)和/或脂肪垫(白色)。然后用钟表镊在相当于卵巢 上部的腹膜开1个小口。这时应尽可能避开血管以防出血。用外科缝合针在腹膜上穿一 根缝合线以便于其后腹膜固定。用无齿镊夹住脂肪垫并带出左侧的卵巢、输卵管与部份 子宫，用动脉夹夹住脂肪垫并将其放在鼠背后侧，这样卵巢与输卵管暴露在腹膜外。在 解剖镜下，用钟表镊尖端轻轻撕开输卵管开口上部的透明膜，开一小口，尽可能避开血 管以防出血模糊视野。将移卵管从开口部插入输卵管，将卵缓慢吹入输卵管，直至第二 个气泡进入壶腹部，不能将矿物油一同吹入。将移卵管略停一下再拔出，以防气泡以至 卵逸出；去除脂肪夹，将所有组织回位腹腔，缝合肌肉和皮肤切口，等小鼠苏醒后放回 动物室饲养。输卵管移卵可在注射当天下午4-6点或次日晨进行。可做单侧或双侧输卵 管移卵。6.转基因鼠的检测6.1利用PCR鉴定转基因鼠剪鼠的耳或脚趾于鼠耳消化液中，55°C消化至少4小时，煮沸5-10分钟，室温 12,000rpm5分钟，上清即可作为PCR模板。鼠耳消化液成分KCl500mM，Tris-HCl lOOMm，明胶(Sigma G2500) O.lmg/ ml, NP-400.45%, Tween20 0.45%,蛋白酶 K(临用时加入)0.5mg/ml。
用于鉴定SIRTl 的引物Pl 5' -CTTCAGGTCAAGGGATGGTAT-3 ‘ (SEQ IDNO 1)，P2 5' -GCGTGTCTATGTTCTGGGTAT-3‘ (SEQ ID NO 2)。PCR扩增 产物长度233bp。扩增SIRTl 的 PCR 反应条件94°C 5 分钟，(94°C 20 秒，53°C20 秒，72°C 30 秒)30循环，72 °C 10分钟。6.2利用Southern杂交鉴定转基因鼠
6.2.1鼠尾基因组DNA的提取麻醉状态下剪取2-3cm长鼠尾，以微火焰去毛，以消毒过的手术剪沿纵轴剪开 鼠尾部皮肤，钳住一头，使皮肤与尾骨剥离。剪碎尾部皮肤组织，置于EP管中，加入 530 μ 1 DNA 抽提缓冲液(IOmM Tris-HCl, pH7.4, IOmM NaCl, 25mM EDTA)、70 μ 1 10% SDS,混勻后，加入40μ1蛋白酶K(10mg/ml)，轻轻混勻后，55°C保温过夜。消 化完全后，加入70 μ 15M NaCl后，用等体积饱和酚抽提去除蛋白，离心去除酚相，将上 清转至另一 EP管，用650μ1酚氯仿异戊醇(25 24 1)抽提，离心后将上清再用 650 μ 1氯仿异戊醇(24 1)混合液抽提一次，取上清转至另一 EP管中，加入等体积异 丙醇，轻轻摇动离心管数次，可见丝状基因组DNA出现，静置待沉淀完全；用tip头轻 挑起沉淀，转移DNA至新EP管中，用70%乙醇洗沉淀两次，晾干后加150 μ ITE溶解沉 淀过夜。溶解完全后，取适量溶液用0.7%琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量，DNA主带应 清晰无降解。做适当稀释后，读取OD26tlnm值及OD28tlnm值，计算DNA浓度。根据所测 结果，用TE缓冲液稀释至终浓度Iyg/μ 1，4°C保存。6.2.2Southern杂交鉴定转基因鼠取15 μ g上述提取的鼠尾基因组DNA，在200 μ 1反应体系中用150单位EcoRI 酶切24小时(杂交目的片段为2.1kb)。酶切体系的配制要点是充分混勻。取1.5 μ 1 在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，观察是否完全酶解。如仍有主带，再加入30单位酶切4小 时。向酶解样品中加入等体积的酚氯仿，混勻10分钟后，12,OOOrpm离心10分钟， 将上清转移到一个新的1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M NaAC,两倍体积的乙 醇，混勻后-20°C放置2小时，12,000rpm，4°C离心10分钟，弃去上清，用70%乙醇洗 涤一次，12,000rpm，4°C离心10分钟，弃去上清。晾干后，加入15μ1ΤΕ溶解。取 1 μ 1稀释到80 μ 1测量OD26tlnm值及OD28tlnm值，计算DNA浓度。取10 μ g酶切后的鼠 尾基因组DNA，在琼脂糖凝胶上于lV/cm条件下电泳，待溴酚兰泳动至距点样孔 约12cm处，停止电泳。电泳完毕，EB染色后紫外灯下观察电泳结果，呈现均一的弥 散状，拍照后，估计条带所在的位置，切除多余的边缘。凝胶经变性、中和。将胶块 倒置于水平玻璃上，胶下有纸桥与20XSSC相连，胶上依次覆盖有尼龙膜、Whatman 3M滤纸、普通新华滤纸或吸水纸及500g重物。室温下转移12-24小时。转移完毕， 检查硝酸纤维素膜上及胶上EB染料分布情况，判断转移效率。用滤纸吸去多余水分， 室温晾干1小时，选C3程序进行紫外交联。将转移了 DNA的尼龙膜在6XSSC中润 湿后，放入杂交管中，加入适量的快速杂交液，42°C预杂交40分钟。在等待预杂交的 过程中标记探针，标记按照随机引物标记试剂盒提供的说明书操作。探针模板对应于 SIRT1 cDNA起始密码子下游160bp_360bp，用PCR产物切胶回收的方法得到。PCR 引物序列如下。P3 5 ‘ -CCCCAGAGCGTGAGGTGC-3 ‘ (SEQ ID NO 3), P4 5' -CGTACAAGTTGTCGGCCAGC-3 ' (SEQ ID NO 4)。预杂交结束后加入标记好 的探针，继续杂交1.5-2小时。杂交结束后洗膜，放射自显影观察结果。结果如图2所示οPCR方法研究转基因小鼠中外源基因的遗传规律，发现各株系转基因小鼠后代 中外源基因的出现频率接近50%，符合孟德尔遗传规律。6.2.3转基因鼠胸主动脉SIRTlmRNA水平的过表达。提取转基因和阴性同窝小鼠胸主动脉中总RNA，进行反转录合成CDNA第一 链。cDNA产物各取Iyl作为模板，所用引物与鉴定转基因小鼠的引物相同，进行PCR 反应。反应产物电泳结果显示转基因动物的胸主动脉样品可以扩增出233bp的阳性条 带，与预期结果一致，而阴性同窝鼠样品中检测不到扩增产物，提示SIRTl在转基因动 物主动脉的特异性表达。同时使用提取的组织总RNA作为模板，进行同样的PCR反应， 转基因组与阴性对照组都没有阳性条带，排除了上述cDNA模板当中基因组DNA污染可 能造成的假阳性。将RT-PCR反应的产物测序，结果显示产物序列与SIRTl转基因序列 相同，这表明在转基因小鼠主动脉内SIRTl能够表达。结果见图3。6.2.4用Western-blot鉴定转基因鼠动脉中的SIRTl表达。取转基因小鼠和阴性同窝小鼠胸主动脉，左颈总动脉勻浆提取蛋白质，用 Western blot发现SIRTl在转基因小鼠中的胸主动脉，左颈总动脉均有表达，阴性同窝小 鼠没有检测到明显的条带(以下如无特殊说明，SIRTl抗体均来源于美国Santa cruz公 司)。结果见图4。6.2.5免疫组化鉴定转基因鼠动脉中膜中SIRTl的表达。最后，用免疫组化的方法检测颈总动脉SIRTl的表达，结果显示在阳性转基因 小鼠颈总动脉中膜中有棕黄色信号，而阴性同窝对照仅有非常微弱的阳性信号(可能是 SIRTl抗体对于内源性SIRTl也有微弱识别能力)，没有加一抗的两组血管作为阴性对 照。说明在血管平滑肌细胞实现SIRTl过表达。结果见图5。实施例2小鼠颈总动脉结扎模型致新生内膜形成三溴乙醇(30mg/kg-50mg/kg)腹腔注射麻醉12_14周雄性C57BL/6小鼠。仰
卧位固定小鼠四肢及头部，使完全暴露颈部，皮肤消毒后行颈上部正中切口。纵向剪开 皮肤及肌层，开口约l-1.5cm。用直和弯眼科镊轻轻分开甲状腺，于右下方撕开鞘膜，可 见有血流搏动的左颈总动脉。用小号弯头止血钳轻轻挑起左颈总动脉，另一侧用小号弯 头止血钳将左颈总动脉和伴行的迷走神经分离，并进一步分离至左颈总动脉分叉处，在 接近分叉处用6号手术缝合线正向反向完全结扎左颈总动脉。将甲状腺位置还原，缝合 伤口。左侧颈总动脉结扎0d，14d，28d的转基因阴、阳性小鼠，经腹腔注射麻醉，待 麻醉充分后进行整体灌流法原位固定组织器官。颈上部正中切口完全剪开颈部皮毛，纵 向剪开皮肤及肌层，用直和弯眼科镊轻轻分开甲状腺，于左、右下方撕开鞘膜，可见已 经结扎的左颈总动脉和未结扎的右侧颈总动脉。小号弯头止血钳轻轻挑起左颈总动脉的 结扎线或右侧颈总动脉周围组织，小心顺势分离颈总动脉，切勿提拉钳夹损伤动脉，力 求反映动脉原貌，做免疫组化的样本取颈总动脉血管分叉(结扎处)至其下0.5cm处至于 中性甲醛溶液中固定24h准备石蜡包埋。
用于分析基因表达水平的组织取材不做甲醛固定，只需用灭菌PBS冲洗循环系 统中残留的血液，取胸腹主动脉、肺脏、肌、肝、肾、心脏液氮速冻，-80°C保存，用于 提取总RNA，作基因表达水平的研究。或提取左颈总动脉总蛋白做目的基因表达水平研 究。一根颈总动脉提取的蛋白不足做一次Western blot，故六个样品组每次每组用3根颈 总动脉一起提取，其结果反映的是这几根颈总动脉目的基因蛋白表达的平均水平。经常规的 组织切片，HE染色后，新生内膜形成从结扎14天开始动脉管腔内出 现新生内膜，到28天动脉管腔内径缩窄近80%并伴有新生内膜的形成，说明造模是成功 的。结扎后28天，与野生型鼠相比，SIRTl转基因鼠的新生内膜面积有显著降低。结 果见图6。经照相后选离结扎位置500 μ m切片用图像分析软件Image pro plus 6.0进行分
析，圈定内腔，内弹力膜和外弹力膜后，软件测量出内腔面积，内膜面积以及中膜面 积，新生内膜厚度由新生内膜面积与中膜面积之比来表示。其他后续分析均在距离结扎 部位500μιη范围内进行。分别统计了结扎14天和28天野生型鼠(WT)和SIRTl转基 因鼠(SIRTl-Tg)颈总动脉的内膜面积，中膜面积，新生内膜面积与中膜面积比(Ι/Μ)以 及新生内膜比率(新生内膜面积与总血管面积比)，发现在结扎后14天，与WT鼠相比， SIRTl-Tg鼠的内膜面积，中膜面积，新生内膜面积与中膜面积比以及新生内膜比率没有 明显变化。而结扎后28天，与WT鼠相比，SIRTl-Tg鼠的内膜面积，新生内膜面积与 中膜面积比以及新生内膜比率都有显著降低(P <0.01)。其中，SIRTl-Tg鼠的内膜面积 仅为WT鼠的46.8%，而新生内膜比率也仅为WT鼠的46.6%。由此可以得出结论，在 SIRTl平滑肌特异性转基因鼠中，由颈总动脉结扎所导致的新生内膜形成受到显著抑制。 结果见图7。实施例3转基因鼠中PCNA的表达作为反映细胞活跃增殖的指标，细胞增殖核抗原(PCNA)被广泛应用。为了进 一步验证SIRTl在体内能显著抑制由颈总动脉结扎所导致的新生内膜形成，首先用SIRTl 免疫组化染色确证了 SIRTl在结扎28天的转基因鼠动脉中层平滑肌中表达，再比较了结 扎28天的WT和SIRTl转基因鼠的PCNA免疫组化染色及PCNA染色指数。在平滑肌 特异表达SIRTl转基因鼠与WT鼠相比，SIRTl转基因鼠PCNA阳性着色(棕褐色或者棕 黄色)细胞数显著减少，内膜PCNA阳性细胞率也显著降低(P < 0.01)。结果见图8。实施例4转基因鼠中血管细胞外基质的形成在血管重塑的进程中，细胞外基质(ECM)蛋白如胶原和纤维结合蛋白的沉着也 起着至关重要的作用。因此，用Masson染色观察SIRTl平滑肌特异性转基因是否对结 扎28天引起的血管重塑有遏制作用。结果发现，在SIRTl转基因鼠中，染成蓝色的胶 原纤维较WT鼠明显减少，胶原面积占整个内膜面积比有明显降低(WT : 55.2% ； Tg 34.6%, P <0.01),说明在转基因鼠中，血管细胞外基质形成受到明显抑制。结果见图 9。实施例5与野生型鼠相比，转基因鼠由颈总动脉结扎引起的凋亡细胞数无显著
差异细胞凋亡也参与了颈总动脉结扎引起的血管重塑过程，为此，通过TUNEL染 色考察了 SIRTl在体内是否通过影响细胞凋亡来抑制血管重塑过程。经统计发现，虽然SIRTl转基因鼠组在内膜中TUNEL阳性细胞数在每1000个细胞和每10000 μ m2均有降 低，但不具有统计学意义。结果见图10。实施例6SIRT1抑制血管平滑肌细胞的增殖在小鼠颈总动脉结扎模型中观察到与野生型鼠相比，平滑肌特异SIRTl转基 因鼠能显著抑制新生内膜形成，明显降低PCNA阳性细胞数，显著降低ECM的形成，但 是并没有发现细胞凋亡有明显的差异。为进一步考察SIRTl是否在体外也能抑制血管平 滑肌细胞增殖并探讨其分子机制，取原代大鼠动脉平滑肌细胞，分别用MOI值为100的 腺病毒Ad-GFP和Ad-SIRTl感染12小时后，换无血清DMEM培基饥饿48小时使细胞 同步化，再用含10% FBS的DMEM培基培养24小时，分别取0小时和24小 时的细胞， 采用[3H]-TdR掺入的方法测定10% FBS对VSMC DNA合成的作用。结果显示10% FBS诱导可以显著增加VSMC的[3H]_TdR掺入量，而过表达SIRTl可使基础状态下和血 清刺激24小时VSMC的[3H]_TdR掺入量显著减少(P < 0.01和P < 0.001)。结果见图 11。过表达SIRTl可以抑制10% FBS诱导的VSMC增殖，为此进一步用流式细胞仪 检测了过表达SIRTl对VSMC在血清刺激时细胞周期改变的影响。首先分别用MOI值为 100的腺病毒Ad-GFP和Ad-SIRTl感染VSMC24小时，然后用无血清DMEM培养基继 续培养24小时使细胞同步化。之后换成含10% FBS的DMEM培养基培养，分别在0、 4、8、12、16、20、24小时检测细胞周期变化。结果显示，通过血清饥饿法可以很好地 使细胞阻滞在G0/G1，通过同步化后，VSMC基本90%以上处于G0/G1期。再重新给予 10% FBS刺激后，在最初的4小时内，细胞仍处于G0/G1期。从8小时开始，Ad-GFP 组的细胞开始进入S期，G0/G1期细胞减少，而Ad-SIRTl组仍处于G0/G1期。12小 时，Ad-GFP组G0/G1期细胞进一步减少，S期细胞明显增多，而Ad-SIRTl组的细胞周 期明显落后于Ad-GFP组。20小时后，两者细胞周期进程间的差距开始减小，直到血清 作用24小时后，由SIRTl引起的细胞周期阻滞效应才逐渐消失。结果见图12。利用大鼠平滑肌细胞系A7r5进行上述的细胞周期检测实验，也发现相似的结 果，过表达SIRTl能在10% FBS重新刺激饥饿的大鼠平滑肌细胞系A7r512，16，20小时 后是细胞阻滞在G0/G1期。结果见图13。实施例7SIRT1抑制血管平滑肌细胞Gl期细胞周期蛋白cyclin Dl, cyclin E及 CDK2和结扎28天颈总动脉中Gl期细胞周期蛋白cyclin Dl的表达过表达SIRTl可以抑制10 % FBS诱导的VSMC增殖，并使VSMC阻滞在Gl 期，因此，用Western blotting检测了 Gl期相关周期蛋白的变化。发现过表达SIRTl 可以下调Gl期重要的相关周期蛋白cyclin Dl, cyclin E及CDK2的蛋白表达水平。结果 见图14。为了验证过表达SIRTl可以下调Gl期相关周期蛋白cyclin Dl，cyclinE&CDK2 的蛋白表达水平，用卩00贴3.1和卩3.131町1质粒转染平滑肌细胞系八10 24小时后，再无 血清培基饥饿24小时，重新换为含10% FBS的DMEM培养基培养，在血清刺激12小时 后，也发现过表达SIRTl可以下调Gl期相关周期蛋白cyclin Dl, cyclin E及CDK2的蛋
白表达水平。结果见图15。利用SIRTl干扰腺病毒感染原代血管平滑肌细胞24小时后，再无血清培基饥饿24小时，在与对照(Ad-U6-vector)相比感染量一致的情况下，换为含10% FBS的DMEM 培养基培养，血清刺激12小时，发现干扰掉SIRTl后能够上调cyclin Dl的蛋白表达水 平，而cyclin E，CDK2的蛋白表达水平变化不大(所用SIRTl抗体来源为Millipore公司 的upstate)。结果见图16。文献报导在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中，伴随VSMC增殖，cyclin Dl蛋白水 平也增高(Slater，Koutsouki et al.2004)。因此，为进一步验证过表达SIRTl是否在体内 也能下调cyclin Dl的表达水平，利用小鼠颈总动脉结扎模型，用Western blot和免疫组 化检测发现结扎28天后，cyclin Dl蛋白表达增高，组化结果显示阳性着色程度明显增 强，而动脉血管平滑肌特异的SIRTl转基因鼠与野生型鼠相比，cyclin Dl蛋白表达明显 降低，并且cyclin Dl的阳性着色程度也明显减低。结果见图17。实施例8SIRT1过表达下调了血管平滑肌细胞中cyclin Dl的mRNA水平进一步在VSMC中观察到，10% FBS可以诱导cyclin Dl mRNA表达水平增高， 而SIRTl过表达则抑制了由10% FBS所诱导的cyclin Dl mRNA表达水平增高。用于 扩增大鼠 cyclin Dl mRNA 的引物P5 5 ‘ -GCGAAGTGGAGACCATCCG-3 ‘ (SEQ ID NO 5) , P6 5 ‘ -GTCCACATCTCGGACGTCG-3 ‘ (SEQ ID NO 6)。 PCR扩增产物长度860bp。 用于扩增大鼠β _肌动蛋白mRNA的引物P7 5‘ -GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3‘ (SEQ ID NO 7), P8 5' -TAGAGCCACC AATCCACACAGAG-3 ‘ (SEQ ID NO 8)。PCR 扩增产物长度 42 Ibp。结果见图I8。实施例9AP-1介导了 SIRTl对cyclin Dl表达的抑制作用之前的研究发现SIRTl抑制cyclin Dl mRNA水平的表达，提示SIRTl可能影响 cyclin Dl启动子的转录活性。cyclin Dl的表达主要受转录水平的调节，多种转录因子 与cyclin Dl启动子的特异性结合位点结合后启动cyclin Dl的转录，其中AP_1 (c-Fos, c-Jun)受血清诱导激活，参与细胞增殖调控，同时c-Fos，c-Jun也激活cyclin Dl，使细 胞越过Gl期，进入S期。本发明在HEK293细胞系里发现SIRTl可以通过降低c-Fos/ c-Jun的乙酰化水平来抑制AP-I的转录活性，提示SIRTl可能是通过与AP-I的相互 作用实现对cyclin Dl的调节。因此，构建了含有大鼠cyclin Dl启动子区的报告基因 (cyclin D1 -Iuc，序列见SEQ IDNO 9,所用引物序列为P9和P10，序列见SEQ ID NO 10-11)，利用荧光素酶报告系统将SIRTl表达质粒和pGL3-cydinDl-luc (各0.2 μ g/孔) 共转染接种于24孔板的AlO血管平滑肌细胞系，与共转染pcDNA3.1和pGL3-Cydin Dl-Iuc的对照相比，SIRTl可以使cyclin Dl的启动子活性降低0.4倍(由1.378降为 0.833)。c-Fos和c-Jun都分别能激活cyclin Dl的启动子活性，与共转染pcDNA3.1和 pGL3-cyclin DHuc的对照相比，c_Fos可以使cyclin Dl的启动子活性增高2.21倍(由 1.378升为3.047)，c_Jun可以使cyclin Dl的启动子活性增高1.9倍(由1.378升为2.625)。 而共转了 pcDNA-SIRTl后，由c_Fos导致的cyclin Dl启动子活性的升高和C-Jun导致的启动子活性的升高均显著降低(分别由3.047降为1.24及由2.625降为1.511)，且有统计 学意义。结果见图19和图20。SIRTl可以下调由C-Fos和C-Jun激活的cyclin Dl报告基因活性，提 示SIRTl可能通过c-Fos和c-Jun调节cyclin Dl的转录。通过预测发现在大鼠cyclin Dl 启动子区(-903-0)内有两个 AP-I 结合位点-818—814 (5’_GTCA_3’) 及-44—41 (5’ -GTCA-3’)，分别对包含这两个位点的大鼠cyclin D1报告基因cyclin Dl-Iuc 截短，获得缺失-818—814 (5’-GTCA_3’) AP-I 结合位点的 cyclin Dl-900-luc (序 列见SEQ ID NO: 12，所用引物序列为Pll和P12，序列见SEQ ID NO: 13-14)，以 及缺失-818—814(5’-GTCA_3’)及-44—41 (5’_GTCA_3’)两个 AP-1 结合位点的 cyclin Dl-200-luc(序列见SEQ ID NO 15，所用引物序列为P13和P14，序列见SEQ ID NO: 16-17)。利用荧光素酶报告系统发现，缺失-818—814 (5’-GTCA_3’) AP-I结合 位点的cyclin Dl-900-luc, cyclin Dl启动子活性有大幅降低，为0.85倍(由1.378降 为0.207)，说明AP-I的结合对cyclin Dl启动子活性的提高起极其重要的作用，但与 pcDNA-SIRTl共转后cyclin Dl-900-luc启动子活性仍有0.4倍(由0.207降为0.123) 降低；而同时缺失-818—814 (5’-GTCA-3’)及-44—41 (5’_GTCA_3’) AP-1 结合位 点的cyclin Dl-200-luc, cyclin Dl启动子活性降低0.94倍(由1.378降为0.088)，与 pcDNA-SIRTl 共转后 Cyclin Dl-200-luc 仅有 0.1 倍(由 0.088 降为 0.078)降低，这说 明-44—41 (5’-GTCA_3’) AP-I结合位点对于SIRTl调节cyclin Dl的启动子活性很重 要。为此，进一步将-44—41(5’-01€入-3’)入 -1的结合位点突变为5’-0^^-3’， 获得cyclin Dl-APm-Iuc (序列见SEQ ID NO: 18，所用引物序列为P15和P16，序列见 SEQ ID NO 19-20)。突变了 AP-I结合位点后cyclinDl启动子活性仍有大幅降低，为 0.79 倍(由 1.378 降为 0.29)，与 pcDNA-SIRTl 共转后 cyclin Dl-APm-Iuc 仅有 0.19 倍 (由0.29降为0.236)降低，这一结果说明SIRTl对cyclinDl启动子活性的降低效应可以 由-44—41(5’-GTCA-3’)AP-l结合位点的缺失而部分消除，提示转录因子AP-1在SIRTl 对cyclin Dl表达降低的调节中起重要作用，而且-44—41 (5’_GTCA_3’) AP-1结合位点对 AP-I参与SIRTl对cyclinDl的调节中起着关键作用。结果见图21和图22。实施例10SIRT1、c-Fos> c_Jun 结合在 cyclin Dl 启动子区研究发现，SIRTl调节基因表达的基本模式是通过结合序列特异的转录因子， 从而被募集到特定基因的启动子或增强子上，对该基因进行调控，或者SIRTl可以作为 去乙酰化酶直接去乙酰化组蛋白 H3、H4 (Leibiger and Berggren 2006) (Vaquero, Scher et al.2004)来调节基因表达。上述结果证明转录因子AP-I在SIRTl对cyclin Dl表达降低 的调节中起重要作用，那么SIRTl是否通过AP-I被募集到cyclin Dl的启动子上，从而对 其进行调控？通过ChIP实验发现在VSMC中SIRTl可以结合在cyclin Dl的启动子区，且 与c-Fos/c-Jun有共同的结合区域(图23)。其中普通PCR中扩增包括AP-I结合位点的 大鼠 cyclin D1 启动子序列的引物为P17 5' GAGGGGGATACCAGAGGACC 3‘ (SEQ ID NO 21)，P18 5' CCTGGCATGTACTCGCTCAAAA 3‘ (SEQ ID NO 22)，产物 长度409bp ；所用实时定量PCR引物为P19 5' TGCTCCCGAGCCCCCT 3' (SEQ ID NO 23)，P20 5' CCCTGTAGTCCGAGTGACGTTACT 3 ‘ (SEQ ID NO 24)，产物 长度109bp。实施例IlSIRTlRNAi干扰增加了 c_Fos和c_Jun在cyclin Dl启动子区的招募通过ChIP实验还发现，当SIRTl被干扰掉后，c-Fos和C-Jun在cyclin Dl启动 子区结合增加，提示SIRTl可能影响C-Fos和C-Jun被募集到cyclin Dl启动子区。实时
定量PCR结 果见图24。
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Nature.369 (6482) 669-71.
序列表
<110>中国医学科学院基础医学研究所
<120>SIRT1在制备下调细胞周期蛋白如cyclin D1表达的药物中的用途
<130>890091CG
<160>24
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223> 引物 P1
<400>1
cttcaggtca agggatggta t 21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223> 引物 P2
<400>2
gcgtgtctat gttctgggta t 21
<210>3
<211>18<212>DNA <213>人工 <220>
<223> 引物 P3 <400>3
ccccagagcg tgaggtgc18
<210>4 <211>20 <212>DNA <213>人工 <220>
<223> 引物 P4 <400>4
cgtacaagtt gtcggccagc20
<210>5 <211>19 <212>DNA <213>人工 <223> 引物 P5 <400>5
gcgaagtgga gaccatccg19
<210>6 <211>19 <212>DNA <213>人工 <220>
<223> 引物 P6 <400>6
gtccacatct cggacgtcg19
<210>7 <211>21 <212>DNA <213>人工 <220>
<223> 引物 P7 <400>7
gagagggaaa tcgtgcgtga c21
<210>8 <211>23<210>11<211>31<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 P10<400>11agtccgctcg agcgggttgg gtccggtgtc t31<210>12<211>972<212>DNA<213> 人工<220><223> 大鼠 cyclin D1 报告基因 cyclin Dl-900-luc 序列<400>12ctgtaagaag gcaaatctca gaccccatcc ccacccccac cccaccccca gcgaggagga 60atagatgaag gaaataatgg ccaccatctt gagctgttgc tgagattttc ggggttttat120tttattttat ttttgagcga gtacatgcca ggctggggac cctttaaagc tcaaagatac180ccctctggcc ctttgcaacc accccagtgc gccaggaggg agcctgcacg agaacttagg 240gctcgtctgg catcttcgcc tgttacacag ttcctgaatt ttacacgtgt tgatgaaatt300gaaagaagtc gaggacgacg ggatttctta gcaatcggtc cgcccgtggg tgccctcgtg 360gcgtcctcgg aaacgcgccc attctctccg cttaagtata gggtgtcctt gcacccccca 420
cgatcccctt ccatacattc tttcttggct tgcgtgtggc ctggcctccc tcctagctgt480ccccctgtcc agagccgccg ctaccccacc ttcacaggtc tcggaggacc cacttgggga 540aagaagcccc cctccccatt gcccttgccc cgctctttcc cagcttagag agaagcagtc 600ccggcgattt gcatatctac gaaggccgag gggggagggg gcaggctttg ggtttgtccc 660cccccacccc cgccgctcac tgctcccgag ccccctcccc ctgcgcccgc ctcggcccgc 720cccccctcct ttttctctgc ccggctttga tctctgctta acaacagtaa cgtcactcgg780actacagggg agttttgttg aagttgcaaa gtcctgcagc ctccagaggg ctgttggcgc 840agtagcagag agctgcagac tccgcgcgct ccggagaccg gtcgtagagc gcgaggcagc 900gcgcgtcagc agcagacacc ggacccaacc cgctcgagat ctgcgatcta agtaagctgg 960catccgtacg tg972<210>13<211>37<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 Pll<400>13
20
agtccgacgc gttaagaagg caaatctcag accccat37<210>14<211>31<212>DNA<213> 人工<220><223> 引物 P12<400>14agtccgctcg agcgggttgg gtccggtgtc t31<210>15<211>197<212>DNA<213> 人工<220><223> 大鼠 cyclin D1 报告基因 cyclin Dl-200-luc 序列<400>15ctcggactac aggggagttt tgttgaagtt gcaaagtcct gcagcctcca gagggctgtt60ggcgcagtag cagagagctg cagactccgc gcgctccgga gaccggtcgt agagcgcgag 120gcagcgcgcg tcagcagcag acaccggacc caacccgctc gagatctgcg atctaagtaa 180gctggcatcc gtacgtg197<210>16<211>37<213> 人工<220><223> 引物 P13<400>16agtccgacgc gtctcggact acaggggagt tttgttg37<210>17<211>31<212>DNA<213> 人工<220><223> 弓丨物 P14<400>17agtccgctcg agcgggttgg gtccggtgtc t31<210>18<211>1060<212>DNA<213> 人工
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<223> 大鼠 cyclin D1 报告基因 cyclin Dl-APm-luc 序列
<400>18
tgcagaacat ttctctatcg ataggtaccg agctcttacg cgtggaggag ggggatacca60
gaggaccctg gccaggataa accggtcact gtaagaaggc aaatctcaga ccccatcccc120
acccccaccc cacccccagc gaggaggaat agatgaagga aataatggcc accatcttga180
gctgttgctg agattttcgg ggttttattt tattttattt ttgagcgagt acatgccagg240
ctggggaccc tttaaagctc aaagataccc ctctggccct ttgcaaccac cccagtgcgc300
caggagggag cctgcacgag aacttagggc tcgtctggca tcttcgcctg ttacacagtt360
cctgaatttt acacgtgttg atgaaattga aagaagtcga ggacgacggg atttcttagc420
aatcggtccg cccgtgggtg ccctcgtggc gtcctcggaa acgcgcccat tctctccgct480
taagtatagg gtgtccttgc accccccacg atccccttcc atacattctt tcttggcttg540
cgtgtggcct ggcctccctc ctagctgtcc ccctgtccag agccgccgct accccacctt600
cacaggtctc ggaggaccca cttggggaaa gaagcccccc tccccattgc ccttgccccg660
ctctttccca gcttagagag aagcagtccc ggcgatttgc atatctacga aggccgaggg720
gggagggggc aggctttggg tttgtccccc cccacccccg ccgctcactg ctcccgagcc780
ccctccccct gcgcccgcct cggcccgccc cccctccttt ttctctgccc ggctttgatc840
tctgcttaac aacagtaacg ttgctcggac tacaggggag ttttgttgaa gttgcaaagt900
cctgcagcct ccagagggct gttggcgcag tagcagagag ctgcagactc cgcgcgctcc960
ggagaccggt cgtagagcgc gaggcagcgc gcgtcagcag cagacaccgg acccaacccg1020
ctcgagatct gcgatctaag taagctggca tccgtacgtg1060
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<223> 引物 P15
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tgatctctgc ttaacaacag taacgttgct cggactacag gggagttttg 50
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<213>人工
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<223> 引物 P16
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caaaactccc ctgtagtccg agcaacgtta ctgttgttaa gcagagatca 50
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22<212>DNA <213>人工 <220>
<223> 引物 P17 <400>21
gagggggata ccagaggacc <210>22 <211>22 <212>DNA <213>人工 <220>
<223> 引物 P18 <400>22
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<210>23 <211>16 <212>DNA <213>人工 <220>
<223> 引物 P19 <400>23 tgctcccgag ccccct
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<223> 引物 P20 <400>24
ccctgtagtc cgagtgacgt tact
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说明 书21/21页
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[037权利要求
1.SIRT1在制备下调哺乳动物包括人的细胞周期蛋白表达的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述细胞周期蛋白是cyclinDl、cyclinE 或 CDK2。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物是提纯的蛋白质类型的药物。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述药物的剂型为适于蛋白质药物应用的 任何剂型。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述药物的剂型为注射剂。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物是表达SIRTl蛋白质的重组核酸 构建体。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述重组核酸构建体的表达载体是任何适 用于基因治疗的表达载体。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于所述表达载体是病毒载体或非病毒载体。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述病毒载体选自重组逆转录病毒载体、 腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或牛痘苗病毒载体，所述非病毒载体 选自噬菌体载体或复制子载体。
全文摘要
本发明涉及SIRT1在制备下调细胞周期蛋白如cyclin D1表达的药物中的用途。特别地，所述药物是提纯的蛋白质类型的药物，其剂型可以是适于蛋白质药物应用的任何剂型。所述药物是能表达SIRTI蛋白的重组核酸构建体，其表达载体可以是任何适用于基因治疗用的表达载体，包括病毒载体如重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、牛痘苗病毒载体等和非病毒载体如噬菌体载体、复制子载体等。
文档编号A61P9/00GK102008718SQ20091009232
公开日2011年4月13日 申请日期2009年9月7日 优先权日2009年9月7日
发明者刘德培, 张庆军, 张慧娜, 李莉, 陈厚早, 高鹏 申请人:中国医学科学院基础医学研究所