专利名称：小麦细胞周期蛋白基因及其分离方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小麦细胞周期蛋白CycD2基因WcycD2的克隆、重组及功能分析与应用，属于分子生物学和生物技术领域。
本发明人根据其它植物中发表的细胞周期蛋白CycD2的氨基酸序列，设计引物，利用反转录一聚合酶链式反应，从小麦中分离出编码细胞周期蛋白CycD2基因WcycD2。进一步构建表达载体，转化模式植物拟南芥，与野生型植物相比，转基因植株生长速率明显增加，生活周期缩短，提前成熟。
发明内容
本发明首次从小麦中分离出编码细胞周期蛋白CycD2全长的cDNA，连接到表达载体上，利用农杆菌侵染转化拟南芥，转基因植株的生活周期比野生相比提前7天左右。
从小麦根尖中提取总RNA，然后将2微克总RNA反转录成cDNA。根据其它植物中的细胞周期蛋白CycD2中保守的氨基酸序列，设计一对引物正向引物5′-ATCGATTGGATTTGGAAGGT-3′反向引物5′-TGC(CT)A(AG)(GC)AGCTG(AC)GTCATCCA-3′进行常规聚合酶链式反应(PCR)，取2μl PCR产物连接到pGEM-T载体上，转化DH5α细胞，进行序列测定。然后进行3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA。具体的PCR试剂与条件为10×反应缓冲液 5μl脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4μl正向引物(5μM) 4μl反向引物(5μM) 4μl模板cDNA4μlTaqDNA聚合酶0.5μl总体积 50μlPCR反应条件为94℃ 3分钟，然后进入下列循环94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。
结果扩增到一个DNA片段。取2μl PCR产物连接到pGEM-T载体(Promega公司产品)，转化DH5α细胞(常用载体宿主细胞)，平板过夜培养。挑取菌斑，提取质粒DNA，用于序列测定。
经过3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA为1821bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。开放阅读框部分为1059bp，由此推得具353个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，表明与已发表的玉米中的细胞周期蛋白D2相比，氨基酸同源性高达69％，表明经过上述克隆步骤得到了编码细胞周期蛋白CycD2的基因。序列表(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*长度1815碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否
(d)反义否(e)最初来源小麦(f)序列描述SEQ IN NO.11TAATTGGCCA CGCGTCAAAA TAGTAAGGAG GAGGGGGGGG GATATAGTTT ATCCTTTTCG 6061 TTTATCTCTT TGACGGATCA AGAACAGGGG AGGGAGATTG AAGGGGGGGA GGAAGCTATG 120121 CATCCAACGC GTTGGGAGCT CTCCCATATG GTCGACCTGC AGGCGGCCGC GAATTCACTA 180181 GTGATTTCTC TAGATAAATC AGTTCTCGCA TCGGTTTATT GATTGCTCAT TAACCCAGCA 240241 TTCCCGCCGC TGCCATTCTT GGGAGGAGTC AGCATGGTTC CGTCCGGGTA CGACTGCGCC 300301 GCCTCCGTCC TGCTCTGCGC CGAGGACAAC GCCGCCATCC TCGGCCTCGA CGACGACGAG 360361 GAAGACTGCT CCTGGGCGGC GGCGGCCGCC ACCCCGCCGC GCATCGCCGC CGATGCCGCC 420421 GCGGCGGCGG AGGGGTTCCT GGTGGACCAC CCCGTGCAGT CCGATGAGTG CGTGGCGGCG 480481 CTCGTCGAGA CGGAGAAGGA GCACATGCCC GCCGACGGGT ACCCCCAGAT GCTGCTGCGC 540541 CGGCCCGGGG CCCTGGATTT GGCCGCCGTC AGGAGGGACG CCATAGATTG GATTTGGGAG 600601 GTCATTGAGC ATTTCAATTT CGCGCCGTTG ACTGCGGTCC TGTCTGTCAA CTACCTTGAT 660661 AGGTTCCTCT CCGTCTATCC CCTTCCTGAA GGCAAAGCTT GGGTGACACA GCTCTTGGCA 720721 GTGGCTTGCT TGTCCCTCGC TTCAAAGATG GAGGAGACCT ATGTGCCGCT CCCCGTCGAC 780781 CTGCAGGTGG TTGAGGCAAA TTCTGCGTTC GAGGGGAGGA CCATAAAAAG GATGGAGCTT 840841 TTGGTGCTCA GCACCTTAAA ATGGAGGATG CAAGCTGTTA CTGCTTGCTC ATTTATTGAC 900901 TACTTCCTGC GCAAATTCAA TGATCATGAC GCGCCCTCCA TGCTCGCATT CTCCCGCTCG 960961 ACCGACCTCA TCCTGAGCAC AGCTAAAGGA GCTGATTTTT TGGTGTTCAG ACCTTCAGAG 10201021 ATTGCTGCAA GTGTCGCACT TGCCGCATTT GGGGAGCGCA ATACTTCAGT AGTCGAGCGG 10801081 GCTACAACTA CTTGCAAGTT CATAAACAAG GAGCGAGTGT TAAGATGCTA CGAACTGATT 11401141 CAAGACAAGG TAGCAATGGG AACCATTGTC CTAAAGTCAG CTGGATCATC AATGTTCTCT 12001201 GTGCCGCAAA GCCCGATAGG CGTGTCGGAT GCTGCTGCAT GTCTCAGCCA ACAGAGTGAT 12601261 GATACTGCTG TTGGATCTCC AGCAACATGC TACCAAGCCT CTTCGGCAAG CAAAAGGAGG 13201321 AGAATTGGCA GATGACCGAT CTCATGTCGT GCTGTGCTTC AGGTGTGTTG CTCACCGTTT 13801381 TGGCTGTTTT GTTGTTTCAA ACATCTCAAT TCAGTTTGGT CACTCGAGAA CTATAGTGTG 14401441 GTCAAGTAGT TGCTGGAAGG AACAAAAACA CCATAGTCAA TACTTGACCC ATAAGAACAA 15001501 ACAGTTCGCC GCGAGCCTGT TCATGCAATC GACATATGTA AGGGGCATGC TAAGCTGTTA 15601561 GTGTCCTGAG ATGCATGCTG TGTAGGCAGA GATGGAGCAA GGAAGTTGCA TGTTGTAGAG 16201621 ATGAGAGCTC TATTGCCCTG TTTTGTATTT TGGTTCCATA TTCAGTTTCT AATGAACTTT 16801681 AGGCAAGGGC TGCTCTGATC ATTGAGGCGG TGAATGAAAA TGATCCTAAA ACGGATCGGC 17401741 TGAGATACAG AACAGTTTAT ATTTGTTCTG ATGAGTTATA AATTTTGTCG ACAAAAAAAA 18001801 AAAAAAAAAA AAAAA 1815(2)SEQ IN NO.2的信息(a)序列特征*长度353氨基酸
*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述1 MVPSGYDCAA SVLLCAEDNA AILGLDDDEE DCSWAAAAAT PPRIAADAAA AAEGFLVDHP 6061 VQSDECVAAL VETEKEHMPA DGYPQMLLRR PGALDLAAVR RDAIDWIWEV IEHFNFAPLT 120121 AVLSVNYLDR FLSVYPLPEG KAWVTQLLAV ACLSLASKME ETYVPLPVDL QVVEANSAFE 180181 GRTIKRMELL VLSTLKWRMQ AVTACSFIDY FLRKFNDHDA PSMLAFSRST DLILSTAKGA 240241 DFLVFRPSEI AASVALAAFG ERNTSVVERA TTTCKFINKE RVLRCYELIQ DKVAMGTIVL 300301 KSAGSSMFSV PQSPIGVSDA AACLSQQSDD TAVGSPATCY QASSASKRRR IGR353根据上述序列，设计构建表达载体的引物正向引物5′-TCTCTAGATAAATCAGTTCTCGCATC-3′反向引物5′-TAGAGCTCCACAGCACGACATGAGATCG-3′以根尖的总RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增出含全长编码框的序列，先连接到pGEM-T载体上，进行测序鉴定。然后用XbaI和SacI切下该片段，插入到表达载体PBI121的35S启动子的下游。将构建好的表达载体转入农杆菌EHA105。
利用渗透法转化拟南芥，收获的种子在含卡那霉素的LB固体培养基上筛选。对T3代纯合植物生长发育进行观察，与野生型相比，转基因植株生长速率明显增加，可提前7天左右成熟。
根据上述技术，从小麦中分离出编码细胞周期蛋白CycD2的基因，该基因过量表达能导致转基因拟南芥的生长速率增加，生活周期缩短。表明该基因表达水平的增加足以促进细胞分裂和植物生长的加速。因此，让该基因在小麦、水稻和玉米等农作物及其它一些观赏植物中过量表达，能够加速植物的生长发育进程，缩短生活周期，将具有非常重要的经济效益和社会效益.(四)具体发明实施方式实施方式1.小麦中细胞周期蛋白CycD2基因的克隆方法1.总RNA的提取采用一步法或RNA kit提取总RNA2.cDNA第一条链的合成取2微克总RNA，加入5×反应缓冲液4μl，10mM脱氧核糖核酸(dNTP)2μl，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/μl)0.5μl，引物oligodT(1μg/μl)1μl，反转录酶(10u/μl)2μl，42℃反应60分钟，85℃10分钟终止反应，稀释至200μl。
3.PCR反应聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为首先将下列试剂混在一起
10×反应缓冲液5μl脱氧核苷酸混合物(dNTP)4μl正向引物(5μM)4μl反向引物(5μM)4μl模板cDNA 4μlTaq DNA聚合酶 0.5μl总体积50μlPCR反应条件为94℃ 3分钟，然后进入下列循环94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。
4.基因克隆取2μl PCR与pGEM-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-T and pGEM-Teasy Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。
5.质粒DNA的提取碱法提取质粒DNA。
6.序列测定本工作在大连宝生物工程公司进行。
7.3′和5′序列的分离按Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit说明书进行8.同源检索利用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。实施方式2小麦细胞周期蛋白CycD2基因WcycD2，具有如下序列(1)SEQ ID NO1的信息(a)序列特征*长度1815碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源小麦(f)序列描述SEQ IN NO.11TAATTGGCCA CGCGTCAAAA TAGTAAGGAG GAGGGGGGGG GATATAGTTT ATCCTTTTCG 6061 TTTATCTCTT TGACGGATCA AGAACAGGGG AGGGAGATTG AAGGGGGGGA GGAAGCTATG 120121 CATCCAACGC GTTGGGAGCT CTCCCATATG GTCGACCTGC AGGCGGCCGC GAATTCACTA 180181 GTGATTTCTC TAGATAAATC AGTTCTCGCA TCGGTTTATT GATTGCTCAT TAACCCAGCA 240241 TTCCCGCCGC TGCCATTCTT GGGAGGAGTC AGCATGGTTC CGTCCGGGTA CGACTGCGCC 300301 GCCTCCGTCC TGCTCTGCGC CGAGGACAAC GCCGCCATCC TCGGCCTCGA CGACGACGAG 360361 GAAGACTGCT CCTGGGCGGC GGCGGCCGCC ACCCCGCCGC GCATCGCCGC CGATGCCGCC 420421 GCGGCGGCGG AGGGGTTCCT GGTGGACCAC CCCGTGCAGT CCGATGAGTG CGTGGCGGCG 480481 CTCGTCGAGA CGGAGAAGGA GCACATGCCC GCCGACGGGT ACCCCCAGAT GCTGCTGCGC 540541 CGGCCCGGGG CCCTGGATTT GGCCGCCGTC AGGAGGGACG CCATAGATTG GATTTGGGAG 600601 GTCATTGAGC ATTTCAATTT CGCGCCGTTG ACTGCGGTCC TGTCTGTCAA CTACCTTGAT 660661 AGGTTCCTCT CCGTCTATCC CCTTCCTGAA GGCAAAGCTT GGGTGACACA GCTCTTGGCA 720721 GTGGCTTGCT TGTCCCTCGC TTCAAAGATG GAGGAGACCT ATGTGCCGCT CCCCGTCGAC 780781 CTGCAGGTGG TTGAGGCAAA TTCTGCGTTC GAGGGGAGGA CCATAAAAAG GATGGAGCTT 840841 TTGGTGCTCA GCACCTTAAA ATGGAGGATG CAAGCTGTTA CTGCTTGCTC ATTTATTGAC 900901 TACTTCCTGC GCAAATTCAA TGATCATGAC GCGCCCTCCA TGCTCGCATT CTCCCGCTCG 960961 ACCGACCTCA TCCTGAGCAC AGCTAAAGGA GCTGATTTTT TGGTGTTCAG ACCTTCAGAG 10201021 ATTGCTGCAA GTGTCGCACT TGCCGCATTT GGGGAGCGCA ATACTTCAGT AGTCGAGCGG 10801081 GCTACAACTA CTTGCAAGTT CATAAACAAG GAGCGAGTGT TAAGATGCTA CGAACTGATT 11401141 CAAGACAAGG TAGCAATGGG AACCATTGTC CTAAAGTCAG CTGGATCATC AATGTTCTCT 12001201 GTGCCGCAAA GCCCGATAGG CGTGTCGGAT GCTGCTGCAT GTCTCAGCCA ACAGAGTGAT 12601261 GATACTGCTG TTGGATCTCC AGCAACATGC TACCAAGCCT CTTCGGCAAG CAAAAGGAGG 13201321 AGAATTGGCA GATGACCGAT CTCATGTCGT GCTGTGCTTC AGGTGTGTTG CTCACCGTTT 13801381 TGGCTGTTTT GTTGTTTCAA ACATCTCAAT TCAGTTTGGT CACTCGAGAA CTATAGTGTG 14401441 GTCAAGTAGT TGCTGGAAGG AACAAAAACA CCATAGTCAA TACTTGACCC ATAAGAACAA 15001501 ACAGTTCGCC GCGAGCCTGT TCATGCAATC GACATATGTA AGGGGCATGC TAAGCTGTTA 15601561 GTGTCCTGAG ATGCATGCTG TGTAGGCAGA GATGGAGCAA GGAAGTTGCA TGTTGTAGAG 16201621 ATGAGAGCTC TATTGCCCTG TTTTGTATTT TGGTTCCATA TTCAGTTTCT AATGAACTTT 16801681 AGGCAAGGGC TGCTCTGATC ATTGAGGCGG TGAATGAAAA TGATCCTAAA ACGGATCGGC 17401741 TGAGATACAG AACAGTTTAT ATTTGTTCTG ATGAGTTATA AATTTTGTCG ACAAAAAAAA 18001801 AAAAAAAAAA AAAAA 1815(2)SEQ IN NO.2的信息(a)序列特征长度355氨基酸类型氨基酸链型单链拓扑结构线性
(b)分子类型蛋白质(d)序列描述1 MVPSGYDCAA SVLLCAEDNA AILGLDDDEE DCSWAAAAAT PPRIAADAAA AAEGFLVDHP 6061 VQSDECVAAL VETEKEHMPA DGYPQMLLRR PGALDLAAVR RDAIDWIWEV IEHFNFAPLT 120121 AVLSVNYLDR FLSVYPLPEG KAWVTQLLAV ACLSLASKME ETYVPLPVDL QVVEANSAFE 180181 GRTIKRMELL VLSTLKWRMQ AVTACSFIDY FLRKFNDHDA PSMLAFSRST DLILSTAKGA 240241 DFLVFRPSEI AASVALAAFG ERNTSVVERA TTTCKFINKE RVLRCYELIQ DKVAMGTIVL 300301 KSAGSSMFSV PQSPIGVSDA AACLSQQSDD TAVGSPATCY QASSASKRRR IGR 353实施方式3表达载体的构建1.根据分离出的细胞周期蛋白CycD2基因的核苷酸序列，设计引物正向引物5′-TCTCTAGATAAATCAGTTCTCGCATC-3′反向引物5′-TAGAGCTCCACAGCACGACATGAGATCG-3′以根尖的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应.
2.取2μl PCR与pGEM-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pGEM-Tand pGEM-TeasyVector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5α菌株，在表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和X-gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，进行序列测定。
3.用XabI和SacI两个限制性内切酶将该基因从pGEM-T载体上切下，与相同酶酶切的PBI121连接。连接产物转化DH5α细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。
4.将构建好的表达载体转化农杆菌EHA105。实施方式4基因功能分析1.种植拟南芥。
2.挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液体培养基中，28℃振荡培养。
3.离心，农杆菌沉淀用渗透培养基(5％蔗糖，0.1M MgCl2，0.5％Silwet L-77)悬浮，菌液OD600在0.8左右。
4.将拟南芥花序浸入渗透液中，浸泡5分钟。
5.收获的种子在筛选培养基(1×MS盐，1％蔗糖，pH5.7，0.8％琼脂，卡那霉素30毫克/升)筛选，得到抗性植株。
6.将T3代纯合株系种子放在与野生型种子在相同的条件下，测量植株的高度，观察其生长发育状况。序列表<110>山东农业大学<120>小麦细胞周期蛋白基因及其分离方法与应用<160>1<170>patent In 3.1<210>1<211>1815<212>cDNA<213>小麦(Triticum aestivum)<221>1-1815<400>1taattggcca cgcgtcaaaa tagtaaggag gagggggggg gatatagttt atccttttcg 60tttatctctt tgacggatca agaacagggg agggagattg aaggggggga ggaagctatg 120catccaacgc gttgggagct ctcccatatg gtcgacctgc aggcggccgc gaattcacta 180gtgatttctc tagataaatc agttctcgca tcggtttatt gattgctcat taacccagca 240ttcccgccgc tgccattctt gggaggagtc agcatggttc cgtccgggta cgactgcgcc 300gcctccgtcc tgctctgcgc cgaggacaac gccgccatcc tcggcctcga cgacgacgag 360gaagactgct cctgggcggc ggcggccgcc accccgccgc gcatcgccgc cgatgccgcc 420gcggcggcgg aggggttcct ggtggaccac cccgtgcagt ccgatgagtg cgtggcggcg 480ctcgtcgaga cggagaagga gcacatgccc gccgacgggt acccccagat gctgctgcgc 540cggcccgggg ccctggattt ggccgccgtc aggagggacg ccatagattg gatttgggag 600gtcattgagc atttcaattt cgcgccgttg actgcggtcc tgtctgtcaa ctaccttgat 660aggttcctct ccgtctatcc ccttcctgaa ggcaaagctt gggtgacaca gctcttggca 720gtggcttgct tgtccctcgc ttcaaagatg gaggagacct atgtgccgct ccccgtcgac 780ctgcaggtgg ttgaggcaaa ttctgcgttc gaggggagga ccataaaaag gatggagctt 840ttggtgctca gcaccttaaa atggaggatg caagctgtta ctgcttgctc atttattgac 900tacttcctgc gcaaattcaa tgatcatgac gcgccctcca tgctcgcatt ctcccgctcg 960accgacctca tcctgagcac agctaaagga gctgattttt tggtgttcag accttcagag 1020attgctgcaa gtgtcgcact tgccgcattt ggggagcgca atacttcagt agtcgagcgg 1080gctacaacta cttgcaagtt cataaacaag gagcgagtgt taagatgcta cgaactgatt 1140caagacaagg tagcaatggg aaccattgtc ctaaagtcag ctggatcatc aatgttctct 1200gtgccgcaaa gcccgatagg cgtgtcggat gctgctgcat gtctcagcca acagagtgat 1260gatactgctg ttggatctcc agcaacatgc taccaagcct cttcggcaag caaaaggagg 1320agaattggca gatgaccgat ctcatgtcgt gctgtgcttc aggtgtgttg ctcaccgttt 1380tggctgtttt gttgtttcaa acatctcaat tcagtttggt cactcgagaa ctatagtgtg 1440gtcaagtagt tgctggaagg aacaaaaaca ccatagtcaa tacttgaccc ataagaacaa 1500acagttcgcc gcgagcctgt tcatgcaatc gacatatgta aggggcatgc taagctgtta 1560gtgtcctgag atgcatgctg tgtaggcaga gatggagcaa ggaagttgca tgttgtagag 1620atgagagctc tattgccctg ttttgtattt tggttccata ttcagtttct aatgaacttt 1680aggcaagggc tgctctgatc attgaggcgg tgaatgaaaa tgatcctaaa acggatcggc 1740tgagatacag aacagtttat atttgttctg atgagttata aattttgtcg acaaaaaaaa 1800aaaaaaaaaa aaaaa 181权利要求
1.一种克隆的小麦细胞周期蛋白基因WcycD2，其特征在于它具有SEQ IN NO1所示的序列，(a)序列特征*长度1815碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源小麦(f)序列描述SEQ IN NO.11TAATTGGCCA CGCGTCAAAA TAGTAAGGAG GAGGGGGGGG GATATAGTTT ATCCTTTTCG 6061 TTTATCTCTT TGACGGATCA AGAACAGGGG AGGGAGATTG AAGGGGGGGA GGAAGCTATG 120121 CATCCAACGC GTTGGGAGCT CTCCCATATG GTCGACCTGC AGGCGGCCGC GAATTCACTA 180181 GTGATTTCTC TAGATAAATC AGTTCTCGCA TCGGTTTATT GATTGCTCAT TAACCCAGCA 240241 TTCCCGCCGC TGCCATTCTT GGGAGGAGTC AGCATGGTTC CGTCCGGGTA CGACTGCGCC 300301 GCCTCCGTCC TGCTCTGCGC CGAGGACAAC GCCGCCATCC TCGGCCTCGA CGACGACGAG 360361 GAAGACTGCT CCTGGGCGGC GGCGGCCGCC ACCCCGCCGC GCATCGCCGC CGATGCCGCC 420421 GCGGCGGCGG AGGGGTTCCT GGTGGACCAC CCCGTGCAGT CCGATGAGTG CGTGGCGGCG 480481 CTCGTCGAGA CGGAGAAGGA GCACATGCCC GCCGACGGGT ACCCCCAGAT GCTGCTGCGC 540541 CGGCCCGGGG CCCTGGATTT GGCCGCCGTC AGGAGGGACG CCATAGATTG GATTTGGGAG 600601 GTCATTGAGC ATTTCAATTT CGCGCCGTTG ACTGCGGTCC TGTCTGTCAA CTACCTTGAT 660661 AGGTTCCTCT CCGTCTATCC CCTTCCTGAA GGCAAAGCTT GGGTGACACA GCTCTTGGCA 720721 GTGGCTTGCT TGTCCCTCGC TTCAAAGATG GAGGAGACCT ATGTGCCGCT CCCCGTCGAC 780781 CTGCAGGTGG TTGAGGCAAA TTCTGCGTTC GAGGGGAGGA CCATAAAAAG GATGGAGCTT 840841 TTGGTGCTCA GCACCTTAAA ATGGAGGATG CAAGCTGTTA CTGCTTGCTC ATTTATTGAC 900901 TACTTCCTGC GCAAATTCAA TGATCATGAC GCGCCCTCCA TGCTCGCATT CTCCCGCTCG 960961 ACCGACCTCA TCCTGAGCAC AGCTAAAGGA GCTGATTTTT TGGTGTTCAG ACCTTCAGAG 10201021 ATTGCTGCAA GTGTCGCACT TGCCGCATTT GGGGAGCGCA ATACTTCAGT AGTCGAGCGG 10801081 GCTACAACTA CTTGCAAGTT CATAAACAAG GAGCGAGTGT TAAGATGCTA CGAACTGATT 11401141 CAAGACAAGG TAGCAATGGG AACCATTGTC CTAAAGTCAG CTGGATCATC AATGTTCTCT 12001201 GTGCCGCAAA GCCCGATAGG CGTGTCGGAT GCTGCTGCAT GTCTCAGCCA ACAGAGTGAT 12601261 GATACTGCTG TTGGATCTCC AGCAACATGC TACCAAGCCT CTTCGGCAAG CAAAAGGAGG 13201321 AGAATTGGCA GATGACCGAT CTCATGTCGT GCTGTGCTTC AGGTGTGTTG CTCACCGTTT 13801381 TGGCTGTTTT GTTGTTTCAA ACATCTCAAT TCAGTTTGGT CACTCGAGAA CTATAGTGTG 14401441 GTCAAGTAGT TGCTGGAAGG AACAAAAACA CCATAGTCAA TACTTGACCC ATAAGAACAA 15001501 ACAGTTCGCC GCGAGCCTGT TCATGCAATC GACATATGTA AGGGGCATGC TAAGCTGTTA 15601561 GTGTCCTGAG ATGCATGCTG TGTAGGCAGA GATGGAGCAA GGAAGTTGCA TGTTGTAGAG 16201621 ATGAGAGCTC TATTGCCCTG TTTTGTATTT TGGTTCCATA TTCAGTTTCT AATGAACTTT 16801681 AGGCAAGGGC TGCTCTGATC ATTGAGGCGG TGAATGAAAA TGATCCTAAA ACGGATCGGC 17401741 TGAGATACAG AACAGTTTAT ATTTGTTCTG ATGAGTTATA AATTTTGTCG ACAAAAAAAA 18001801 AAAAAAAAAA AAAAA 1815
2.一种权利要求1所述的细胞周期蛋白基因的克隆方法，其特征在于从小麦中提取总RNA，然后利用2微克总RNA反转录成cDNA，根据其它植物中的细胞周期蛋白CycD2保守的氨基酸序列设计一对引物正向引物5′-ATCGATTGGATTTGGAAGGT-3′反向引物5′-TGC(CT)A(AG)(GC)AGCTG(AC)GTCATCCA-3′进行常规聚合酶链式反应，将扩增出的DNA片段连接到pGEM-T载体上，转化DH5α细胞，用于序列测定，然后经过3’/5’末端快速扩增得到全长的cDNA为1815bp。
3.一种权利要求1所述的细胞周期蛋白基因的功能，其特征在于该基因在拟南芥中过量表达，能加速植物的生长进程，转入小麦、水稻和玉米等农作物中，缩短植物的生活周期。
全文摘要
本发明涉及小麦细胞周期蛋白CycD2基因WcycD2的克隆、重组及功能分析，属于分子生物学和生物技术领域。从小麦根尖中提取总RNA，然后将2微克总RNA反转录成cDNA。根据其它植物中的细胞周期蛋白CycD2中保守的氨基酸序列，设计引物，进行常规聚合酶链式反应(PCR)，然后连接到pGEM－T载体上，转化DH5α细胞，进行序列测定。然后进行3′和5′末端快速扩增获得全长的cDNA。进一步，构建正义表达载体，转化拟南芥。与野生型植物相比，转基因植株生长速率明显增加，生活周期缩短，提前成熟。该基因在拟南芥中过量表达能大大加速植物的生长进程。因此，该基因可用于转入小麦、水稻和玉米等农作物中，达到加速植物生长进程的目的，具有重要的应用前景。
文档编号C12P19/34GK1408721SQ0213554
公开日2003年4月9日 申请日期2002年9月18日 优先权日2002年9月18日
发明者张宪省, 王芳, 李全梓, 李兴国 申请人:山东农业大学