筛选参与植物细胞周期的基因的方法

专利名称：：筛选参与植物细胞周期的基因的方法筛选参与植物细胞周期的基因的方法本发明涉及筛选涉及和/或参与植物细胞周期的蛋白质的方法，还涉及用所述方法分离的蛋白质以及这些蛋白质和/或编码这些蛋白质的基因在调控植物产量和植物生长中的用途。了解基本的细胞周期机构(cell-cyclemachinery)是掌握信号途径如何在不断变化的环境中在植物生长和发育过程中影响细胞周期并调节细胞增殖的前提条件。细胞分裂的重要基本机制在所有真核生物是保守的，但植物本身的固着生存方式使之演化出独特的特征。植物基因组序列分析发现，与其他生物体相比，植物中存在数量巨大的参与细胞增殖的基因(Capron等，2003；Vancbpoele等，2002；Menges等，2005；Schultz等，2007)。微阵列分析发现，这些基因中有许多均具有细胞周期依赖型表达谱(cellcycle-dependentexpressionprofile)(Menges等，2005)，支持它们在细胞周期调节中的角色。为了阐明哪些分子机构参与了植物细胞分裂，我们使用“核心(core)”细胞周期蛋白作为诱饵通过TAP从拟南芥(Arabidopsisthaiiana)细胞悬浮培养物(VanLeene等，2007;VanLeene等，2008)分离了细胞内复合体。针对非特异性相互作用修正了数据集，然后将数据集分为在至少两次独立的重复验证中经生物学方法均得到确认的相互作用的“核心”数据集，和“非核心”数据集。令人惊讶的是，除了已知的细胞周期蛋白之外，我们发现这些数据集中还包括一些蛋白质，而它们在细胞周期中的作用以前从未被披露过。通过不同的计算分析以及通过网络生物学解释证实了所述核心数据集和非核心数据集的稳健性(robustness)。相互作用组(interactome)充当了出色的假设产生工具并实现了其功能，当与其他数据整合时尤其如此。将我们的相互作用组数据与细胞周期相关性表达谱相组合，可以了解到例如哪些CDK/细胞周期蛋白复合体在细胞分裂过程中具有活性以及何时具有活性。这些数据表明，植物中存在数量众多的细胞周期调节物并非仅仅是冗余性的结果，而是在于不同的细胞周期调节物在复合体中的组合产生了功能的多样性，导致植物细胞周期具有高度的复杂性和适应性。本发明的第一方面涉及分离新的细胞周期相关蛋白的方法，包括(1)使用已知的细胞周期蛋白作为诱饵进行tap分析，(2)针对非特异性相互作用修正结果，和(3)对修正的结果进行再确认。在本申请中，可以如下方式对结果进行再确认重复进行所述tap-标记物(tap-tag)实验；或者进行反向tap-标记物实验(reversedtap-tag)，其中将最初的捕获物用作现在的诱饵。本发明的另一方面涉及以本发明的方法所分离到的细胞周期相关蛋白用于调控植物生长和/或产量的用途。在优选的实施方式中，所述植物是农作物，优选地是单子叶植物或谷类，更优选地是选自如下一组的谷类稻、玉蜀黍、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱和燕麦。在本申请中，所述用途是所述蛋白质的用途，和/或是编码所述蛋白质的核酸或其互补体的用途，其包括，但不限于，基因组DNA、cDNA、信使RNA(包括5’和3’非翻译区)和RNAi；作为非限制性的实例，所述用途可导致过表达所述基因或抑制所述基因表达。可通过将目的在于所述过表达或所述抑制表达的遗传构建体转移至植物内而获得靶基因过表达或抑制靶基因表达。将外来基因转移至植物基因组内称为转化。植物的转化是本领域人员已知的相当常规的技术。有利地，任何转化方法均可用于将感兴趣的基因引入合适的前体细胞中。用于从植物组织或植物细胞转化植物并再生植物的方法可用于实现瞬时或稳定转化。转化方法包括但不限于土壤杆菌介导的转化、使用脂质体、电穿孔、增加DNA自由摄取的化学品、将DNA直接注入植物、粒子枪轰击、使用病毒或花粉转化或显微投射。优选地，所述细胞周期相关蛋白选自Atlg56110、At3gl7020、At3g21140、At5g25460、At5g60790、At4g38900、At3g49240、At5g24690、Atlg06070、At4g34150、Atlg20480、At5g20920、At3gl5970、At5gl3030、Atlg01880、At5g07310、At2g46610、Atlgl0690、At3g04710、At3g24690、At4gl6130、At2g05830、Atlg29220、Atlg55890、Atlg60650、Atlg70830、At2g43140、Atlg77180、At5gl8620、At5g02530、At5gl4170、Atlg52730、At2g33340、Atlg03060、At3g62240、At4g38740、At5g61220、At3g53880、At3g56860、Atlg01970、Atlgl9520、Atlgl4620、At2g03820、At3g01280、At3g56690、At5g41190、At5g03740、Atlg42440、At2g28450、Atlg09760、Atlgl0840、At3gll830、At5g54900、Atlg31760、Atlg61870、At3gll760、Atlg05805、Atlg29200、At4gl3850、At4g38780、Atlg71380、At3gl3640、At5g25060、Atlg43700、At2g46020、At3g55760和At5g21160或其变体。在本申请中，变体包括但不限于所述细胞周期相关蛋白的同源物、直系同源物和旁系同源物。蛋白质的“同源物"涵盖这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们与未修饰的被研究蛋白质相比具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并与从中衍生出它们的所述未修饰的蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性。直系同源物和旁系同源物涵盖用于描述基因的祖先关系的进化概念。旁系同源物是同一物种内通过祖先基因的复制而产生的基因；直系同源物是来自通过物种形成而产生的不同生物体、但也来源于共同的祖先基因的基因。优选地，如以BLASTp(Altschul等，1997；Altschul等，2005)测定，所述同源物、直系同源物或旁系同源物在蛋白质水平的序列相同性为至少50^^51%,52^^53^^54%或55%、56%、57%、58%、59%、优选地为至少60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、更优选地为至少70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,要更优选地为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%最优选地为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高。优选地，所述用途是过表达编码细胞周期相关蛋白的基因，还要更优选地是过表达选自如下一组的本发明的细胞周期蛋白Atlg56110、At3gl7020、At3g21140、At5g2M60、At5g60790(SEQIDN01-5)、或其变体。优选地，所述过表达导致植物生长和/或产量的增加。通过将包含本发明所使用的基因的测试植物与生长于相同条件下的作为对照的亲代非转化植物进行比较而测量植物生长和/或产量的增加。优选地，以生物量产生的增加来测量生长的增加。“产量”指的是这样一种情况，其中仅植物的一部分中的生物量增加，优选地是植物具有重要商业价值的部分，例如叶、根或种子。在本申请中，术语“增加”是指与本申请中所定义的对照植物相比，产量和/或生长多出至少5%、6%、7%、8%、9%或10%、优选地至少15%或20%、更优选地25%、30%、35%或40%。在本申请中，植物生长的增加优选地以总的植物生物量、叶生物量、根生物量和种子生物量中的任何一或多种的增加来测量。在一个优选的实施方式中，所述增加是总的植物生物量的增加。在优选的实施方式中，所述植物是农作物，优选地是单子叶植物或谷类，还要更优选地是选自如下一组的谷类稻、玉蜀黍、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱和燕麦。本发明的再一方面涉及通过本发明的方法分离到的新的细胞周期相关蛋白。图1:(A)核心数据集和非核心数据集的富集分析。具有统计学显著性的富集以*(P_值<0.05)或**(P-值<0.01)表示。对显示细胞周期调节性表达的(周期性)基因、启动子中含有E2F或MSA共有基序的基因和含有CDK共有磷酸化位点的蛋白质进行富集分析。(B)具有至少两个特征的整个基因库(基因组范围)、518个基因的细胞周期集合、诱饵蛋白(无反向诱饵)和核心捕获物和非核心捕获物(无细胞周期集合)的百分比。P-值显示为红色。(C)核心数据集(红色曲线)和非核心数据集(绿色曲线)的转录物PCC的分布，与含有等量相互作用和基因的100个随机网络的平均分布(黑色和灰色曲线)相比。图2整个基因库(基因组范围)、518个细胞周期基因的集合和诱饵蛋白(无反向诱饵)中细胞周期相关特征数量的分布。图3:子网的概貌。图4以空载体转染的对照株系的鲜重。每一独立株系分析大约100株植物(Cl和C2)。图5植物的分布与其鲜重的关系。图形代表属于特定重量类别的植物的频率。图6植物的分布与其鲜重的关系。图形代表属于特定重量类别的植物的频率(植物的百分比对鲜重类别，如图5所示)。所分析的株系是图5所示植物的独立株系。实施例实施例中的材料和方法克隆和TAP纯化按照以往文献报道进行克隆置于组成型花椰菜烟草花叶病毒35S启动子控制下的编码标记物融合物的转基因、拟南芥属细胞悬浮培养物的转化、蛋白提取物制备、TAP纯化、蛋白质沉淀和分离(VanLeene等，2007)。用于纯化掺有标记了GS的诱饵的蛋白复合体的改进方案参见其他文献(VanLeen等，2008)。为了进行质谱鉴定，对以往文献报道的方案进行了小的调整(VanLeene等，2007)，见下文所述。蛋白质水解和肽的分离脱色后，将凝胶片在水中洗涤1小时，在25mL含6，66mMDTT的50mMNH4HCO3中作用40分钟还原多肽的二硫键，随后在25mL含55mMIAM的50mMNH4HCO3中作用30分钟使巯基烷基化。用水洗涤凝胶片3次，将蛋白质凝胶上的完整条带切成条，收集到微滴定板中，并基本上按照以往文献报道(VanLeene等，2007)处理，仅有少许改动。在每一微滴定板孔内，将脱水凝胶颗粒在20μL消化缓冲液中4°C再水化30分钟，该缓冲液含有250ng胰蛋白酶(MSGold；Promega,Madison,WI),50mMNH4HCO3和10%CH3CN(v/v)。加入10μL含有50mMNH4HCO3和10%CH3CN(ν/ν)的缓冲液后，在37°C消化蛋白质3小时。所得的肽以微型柱固相尖头(PerfectPureC18tip，200nL柱床体积；Eppendorf，Hamburg，Germany)浓缩并脱盐，然后直接在MALDI靶板(0pti-T0FTM384WellInsert；AppliedBiosystems,FosterCity,CA)上使用1.2μL以α-氰基-4-对羟基桂皮酸饱和的50%CH3CN0.1%CF3COOH溶液洗脱，并加入20fmole/yLGlul纤维蛋白肽B(SigmaAldrich),20fmole/μLdes-Pro2-缓激肽(SigmaAldrich)和20fmole/μL人促肾上腺皮质激素片段18-39(SigmaAldrich)。获取质谱使用MALDI串联MS设备0700and4800ProteomicsAnalyzer；AppliedBiosystems)获取肽质量指纹以及后续的选定肽的IkVCID片段化谱。使用基本上按照以往文献报道的设置(VanLeene等，2007)获得肽质谱和肽序列谱。根据生产商的说明校正每一MALDI板。所有肽质谱指纹化(PMF)谱以以下三种内标进行内部校正m/z963.516(des-Pro2-缓激肽)、m/z1570.677(Glul-纤维蛋白肽B)、和m/z2465，198(促肾上腺皮质激素片段18-39)，这为所分析的MALDI靶上的每一被分析肽点产生了5ppm士IOppm的平均质量准确度。使用单个PMF谱，对通过质量排阻过滤器的信噪比超过20的多达16种肽进行片段化分析。基于MS的蛋白质同源性鉴定使用所附软件包(GPSExplorer3.6，AppliedBiosystems)基本上按照以往文献报道的参数设置(VanLeene等，2007)处理每一样品的PMF谱和肽序列谱。产生数据搜索文件并使用局部数据库搜索引擎(Mascot2.1，MatrixScience)进行蛋白质同源性鉴定。从9个公共数据库汇编出称为SNAPS拟南芥版本0.4(SNAPS=SimpleNon-redundantAssemblyofProteinSequences,77488个序列条目，30468560个残基，来自http//www.Ptools.ua.ac.be/snaps)的内部非冗余拟南芥属蛋白质数据库。保留相对积分超过95%可能性的最高命中(第一级)的蛋白质同源性鉴定。当积分超过98%可能性阈值时保留额外的阳性鉴定(第二级或更高)。由于鉴定是以不同版本的SNAPS-数据库(VanLeen等，2007)进行的，且目的在于获得这些鉴定之间更多的均一性，因此对来自核心数据集和非核心数据集的所有鉴定进行Mascot并以来自最新版TA^数据库(TAIR8.0)的蛋白质序列库进行鉴定。此外还进行额外的限制以降低假阳性鉴定的数量等等，舍弃超过50%的相应的肽具有胰蛋白酶错切的那些鉴定。GO富集分析在Cytoscape(Shannon等，2003)中使用BiNGO工具(Maere等，2005)进行了GO术语的过度表现和表现不足分析。以BenjaminiandHochberg假发现率校正(BenjaminiandHochbergFalseDiscoveryRateCorrection)选择显著性值为0.05的超几何检验进行多重检验。分析中所使用的拟南芥属基因注释文件是于2008年10月4日从GeneOntology网页下载的。细胞周期富集分析对于周期性基因富集分析，从两种数据集(Menges等，2003；Jensen等，2006)汇编了显示出细胞周期调节型表达和细胞周期相关性表达的1258个基因。基因组宽度对应于AffymtetrixATHl微阵列上存在的所有23834个基因。通过将转录物表达数据与比较基因组学(Vand印oele等，2006)组合而在硅片上(insilico)确定了启动子序列中含有E2F或M-特异性激活物(MSA)基序的那些基因。在此，基因组宽度对应于19173个基因，这些基因在ATHl微阵列上具有独特探针组。将含有CDK共有磷酸化位点[ST]PX[KR](其是已知为⑶K底物的标志(DeVeylder等，1997))的蛋白质视为潜在的⑶K底物。使用可得自TAIR的Patmatch工具筛查是否存在该共有基序，且因此，基因组宽度在此对应于TAIR8.06公布中存在的所有27235种蛋白质。对于所有富集分析，以Matlab7.5软件的超几何累积分布函数计算P-值。将不能被分配至特定基因座的蛋白质从所有富集分析中剔除。与蛋白质-蛋白质数据库的重叠为了评估细胞周期相互作用组的新颖性，我们对我们的数据集与以下含有蛋白质-蛋白质相互作用的数据库的重叠情况进行了筛查TA^(HUala等，2001)、InTact(Kerrien等，2007)、ArabidopsisReactome(Tsesmetzis等，2008)、AtPID(Cui等，2008)、Reactome(Vastrik等，2007)和拟南芥功能性基因组学的生物阵列源(BAR)(TheBio-ArrayResource(BAR)forArabidopsisFunctionalGenomics)(Geisler-Lee等，2007)。共表达分析基于关注于细胞周期和植物生长发育的518个实验的拟南芥属ATHl微阵列概要而计算代表基因对的共表达程度的转录物皮尔逊相关系数(PearsonCorrelationCoefficient，PCC)(表7)。我们比较了两种数据集的PCC分布与100个具有同等数量的随机选择的蛋白质和相互作用的随机化数据集的PCC分布。构建体和植物转化使用(Gateway克隆技术产生过表达构建体。通过PCR从提取自拟南芥Columbia生态型的组织的反转录的RNA扩增感兴趣的基因的cDNA(表，产生的OE和请求的LOF页)。使用Wiusion高保真DNA聚合酶(Firmzymes)按照生产商的说明进行PCR反应。使用Gateway系统(Invitrogen)通过attBfcittP重组位点将对应于感兴趣的基因的完整cDNA的PCR片段引入pDONr201，随后通过attLXattR位点重组而重组至pK7WG2表达载体中。通过测序对序列进行确认。使用含有置于CaMV35S启动子控制下的感兴趣基因的构建体，通过花浸法(flowerdipmethod)(CloughandBent,1998)转化拟南芥。植物材料和生长条件通过在补充了50mg/l卡那霉素的MS培养基(1/2浓度的MurashigeandSkoog培养基(Duchefa，Haarlem，TheNetherlands)，含1%蔗糖)上进行选择而鉴定了转基因株系，随后转移至土壤中以产生种子。在MS加卡那霉素上进行第二次选择，由此得以选择出含有一个转基因插入位点的株系。植物生长在21°C和16小时光照和8小时黑暗方案的条件下。生物量测试为了测量生物量，收获在MS培养基中生长20天的植物的营养部分(vegetativepart)，并通过对每一株系的60株植物进行称重而测量鲜重。实施例1分离TAP复合体作为诱饵，我们使用了73种“核心”细胞周期调节蛋白(Vand印oele等，2002；Menges等，2006；Perez等，2007)、4种有丝分裂检查点蛋白(Menges等，2005)、8种后期促进复合物(APC)亚单位和6种APC激活物(Capron等，200、1种26S蛋白酶体亚单位(BruWiin等，2005)、10种参与DNA复制或修复的蛋白质(Schultz等，2007)和作为概念验证的6种用于反向TAP实验的蛋白质(表1)。在这108种TAP融合物中，有102种被成功表达。总共进行了303次纯化，其中每种诱饵至少两次独立的纯化。实施例2鉴定捕获物蛋白通过MALDI-T0FT0F鉴定纯化的蛋白质。将通过对照纯化所确定的非特异性蛋白质从命中列表(表幻中减掉，产生了393种蛋白质中的857种相互作用的非冗余数据集。将该数据集分为196种蛋白质中的371种相互作用的“核心”数据集(含有在至少2次独立重复实验中或在交互实验(reciprocalexperiment)中经生物学方法证实的相互作用)和320种蛋白质中的其他486种相互作用的“非核心”数据集。实施例3富集分析为了评估相互作用组的质量，我们对核心捕获物和非核心捕获物进行了不同的富集分析。在这两种数据集中，GO术语“细胞周期”均高度富集(表3)。额外的GO富集证实细胞周期与众多方面的生物学过程相关联，包括生长和发育、对应激和激素刺激的应答、能量的产生、染色质重构等等。随后，我们观察到核心数据集中存在在细胞周期过程中周期性表达的基因的富集(图1A)。此外，对这两个数据集中在其启动子中具有E2F或M-特异性激活物(MSA)基序的基因进行富集。非核心数据集中的富集较不显著，这表明其对将核心细胞周期机构与其他途径相关联的相互作用更具偏向性。对此构成支持的是，通过CDK磷酸化位点的存在情况进行评估发现，潜在的CDK底物在非核心数据集中更加富集。导致这些相互作用通常未被确认的原因很可能是例如CDK/底物相互作用具有瞬时的特征。实施例4分离新的细胞周期基因为了寻找新的细胞周期相关蛋白，我们整合了不同的细胞周期相关特征(表4)。每一基因的特征数量的分布显示，相对于整个基因库而言，已知的细胞周期基因的集合(表5)富集了这些特征(图幻。有两个特征在整个基因库与细胞周期集合之间显示出明显的变化，在最初的诱饵列表中也是如此，这确认了我们的诱饵的选择。为了寻找新的细胞周期蛋白，我们从核心捕获物和非核心捕获物列表出发，并减掉已知的细胞周期基因的集合。图IB显示了符合具有至少两个特征这一标准的百分比，与整个基因库相比，所有的类别均有显著的富集。通过过滤含有至少两个特征的基因，我们从核心和非核心数据集产生了123个潜在的新的细胞周期基因(表6)。观察到在诱饵之间有46%的核心数据集相互作用和8%的非核心数据集相互作用，这进一步例证了数据的稳健性，这是因为我们的诱饵被认为是在共同的途径中起作用。通过筛查我们的数据与已有的蛋白质-蛋白质相互作用数据库的重叠情况，发现66%的核心数据集相互作用和95%的非核心数据集相互作用是新的。另一方面，这提示三分之一的核心数据集是通过其他手段确认的。最后，通过计算转录物皮尔逊相关系数(PCC)进行评估发现，与来自随机化的数据集的相互作用相比，来自这两个数据集的相互作用均倾向于更多被高表达(图1C)。可通过CytoscapeWebstart评估整合的细胞周期相互作用组，并以矩阵数据透视表(matrixpivottable)的形式给出，这使得能够容易地查询相互作用组。为了证实相互作用组的生物学意义，在下文中讨论了覆盖来自核心数据集和非核心数据集这两者的相互作用的子网的选择(图3)。实施例5分离的⑶K复合体的基因细胞周期进程的关键角色是细胞周期蛋白依赖型激酶(CDK)复合体。CDKA；1是酵母cdc2/cd(^8的拟南芥属同源物，其与所有测试的D-型细胞周期蛋白共纯化，并与A3-型细胞周期蛋白共纯化，但不与有丝分裂Al-、A2-或B-型细胞周期蛋白共纯化。将我们的相互作用组数据与表达数据(Menges等，2005)相组合，我们推测，在再进入细胞周期时和Gl-期的早期，CDKA；1结合CYCD3；3和CYCD5；1。进一步在Gl-期以及在G1/S检查点，CDKA；1结合各种D-型细胞周期蛋白，例如CYCD4；1、CYCD4；2、CYCD3；1、CYCD6；1和CYCD7；1。此外，CDKA；1与S-期特异性A3-型细胞周期蛋白相互作用。绝大多数在G2/M-边界具有峰值表达的其他的A-型和B-型细胞周期蛋白结合植物特异性有丝分裂B-型CDK。Bl-型细胞周期蛋白仅与B2-型CDK相关联，而其余的A-型和B-型细胞周期蛋白优先结合Bl-型CDK0尽管以TAP筛查瞬时相互作用的难度更大，但我们的相互作用组含有不同的潜在CDK底物。正如预期的那样(Geisler-Lee等，2007)，CDKA；1在核心网络中是高度连通的中心。其共纯化了未知蛋白AT4G14310，后者还与CKS1、CKS2、CYCA3；1、CyCA3；4和KRP2存在于复合体中，而反向纯化证实其与CDKA；1和CKS2相互作用，并发现其与参与分裂平面确定过程的植物特异性驱动蛋白(kinesin)动力蛋白KCA2相互作用。随后，以通过RPWa纯化的26S蛋白酶体复合体使得CDKA；1解离，这可能反映出^S蛋白酶体的细胞周期调节作用。CDKA;1还与来自UDP-木糖生物合成途径的3种蛋白质相互作用，这将细胞周期调节作用与细胞壁合成关联起来(Siefert，2004)。使用3种A-型细胞周期蛋白，我们挑出了DNA修复蛋白，使用CYCBl；3，我们发现了Y-微管蛋白和纺锤极体成分，这两种蛋白质参与微管成核作用，例如在早前期带的组装过程中，所谓早前期带是细胞周期过程中确定极性所需的特殊植物结构(Erhardt等，2002)。此外，还以不同的细胞周期蛋白鉴定到一些有趣的染色质重建蛋白CHR17，这是一种被E2F上调的ISWI蛋白(Huanca-Mamani等，2005)，其与CYCD3；2和CYCD5；1相互作用。CHCl与CYCAl；UCYCD7；UCYCB2；3和CKS2相关联，以CYCBl；3和CYCB2；3鉴定到了BRAHMA，这是一种SWI/SNF染色质重建ATP酶，可能在成胚过程中参与子叶边界细胞的形成和/或维持(Kwon等，2006)。实施例6分离细胞周期的正调节物CDK要发挥全部活性，需要在结合细胞周期蛋白之后通过CDK活化激酶(CAK)磷酸化其T-环中的苏氨酸残基。拟南芥属基因组编码4种CAK，即3种D-型CDK(它们是人⑶K7的同源物)和1种细胞周期蛋白非依赖型CAK-活化激酶(CAKAK)⑶KF；1。在此，我们发现⑶KD；2和⑶KD；3均与CYCH；1和CAK组装因子MATl形成三聚体复合体。与稻中的情况(Rohila等，2006)类似，⑶KD；2也是参与转录和DNA修复的基本TFIIH复合体的一部分，因为3个成员被共纯化(UVH6/XPD、AT1G55750和AiMGH(^O)。在这个复合体中，⑶KD；2通过磷酸化RNA聚合酶II的C端结构域(CTD)而激活转录。以UVH6和MATl为诱饵，我们证实了与⑶KD；2的相互作用，并纯化了TFIIH复合体的另外两种蛋白质。⑶KD；2还共纯化参与核苷酸生物合成的蛋白质，即3种核糖磷酸焦磷酸激酶。更上游一些，单体CAKAKCDKF；1以细胞周期蛋白非依赖型方式激活⑶KD；2。另一方面，⑶KF；1也结合⑶KG；2。G-型⑶K类在拟南芥属中具有两个成员，并与人胞质分裂相关性P58半乳糖基转移酶蛋白同源。在此，我们发现，CYCLl(—种具有SR样剪接结构域的细胞周期蛋白(i^rment等，2002))是这两种G-型⑶K的调节性细胞周期蛋白伴侣，在组织特异性基因表达分析(Menges等，2005)中确认CYCLl与⑶KG；2成簇。核心和非核心相互作用蛋白质均提示⑶KG/CYCL复合体在调节转录和剪接中具有功能，因此在细胞增殖过程中CDKF；1的活化会导致剪接的改变。实施例7分离细胞周期的负调节物通过小蛋白质在CDK/细胞周期蛋白复合体中的入坞而实现细胞周期进程的负调节。拟南芥属编码7种与哺乳动物Kip/Cip抑制物相关的蛋白质，称为Kip相关蛋白(KRP)。在此，我们发现，除了KRP1，所有KRP均既与CDKA；1相互作用也与D-型细胞周期蛋白相互作用。使用三种KRP、CDKBl；2和两种APC激活物，我们发现了乙烯反应性AP2转录因子(TF)，使用KRP2，我们挑出了bZIPTF，使用B-型细胞周期蛋白和⑶KBl；2也发现了后者。在植物中，存在第二个细胞周期抑制物蛋白家族，它们被非生物性应激和生物性应激上调，包括SIAMESE(SIM)和SIAMESE相关(SMR)蛋白(Peres等，2007；Churchman等，2006)。SIM是核蛋白，在毛状体(trichomes)中通过抑制有丝分裂而促进核内复制。认为其通过抑制⑶KA；1/CY⑶复合体而抑制有丝分裂(Churchman等，2006)。但在我们的数据集中，SIM共纯化⑶KBl；1，但不共纯化⑶KA；1，因此可能是通过抑制有丝分裂性⑶KB/细胞周期蛋白复合体而直接触发核内复制。在SIM之后，SMRl和SMR2也与⑶KBl；1相关联，而⑶KBl；1相互作用物CYCB2；4结合AT2G^330，后者是SMR家族的又一成员。相反，SMR3-5结合CDKA；1和D-型细胞周期蛋白。此外，使用CDKA；1和不同的D-型细胞周期蛋白作为诱饵，我们挑出了SMR家族的两个新成员，AT5G40460和AT1G10690，而反向纯化证实了这些相互作用。由于AT5G40460在过表达E2!^a和DI^a的植物中被诱导了几乎20倍(Vand印oele等，2005)，其可以在S-期过程中抑制⑶KA；1/CY⑶复合体，以防止DNA复制重新起始。SMRl还共纯化bZIP69，使用KRP3和KRP5也发现了bZIP69这一TF。核转运蛋白(Importins)也均与KRP和SMR共纯化，这支持它们的亚细胞定位的调节对于它们的活性具有重要意义。实施例8分离参与核苷酸合成、DNA复制和DNA修复的基因在G1/S边界，⑶K通过磷酸化阻抑物RBR而活化E2F/DP途径，诱导主要参与核苷酸合成、DNA复制和DNA修复的基因的转录。我们证实，E2Fa和Ε2^可与DI3a和DI^b这两者相关联，并且所有E2F和DP蛋白质均与RBR共纯化。由于⑶KBl；1与DEL3(缺乏反式激活结构域的不典型E2F蛋白)相互作用，我们认为DEL3受到CDKBl；1活性的调节，这与DEL3在G2/M处的第二个表达峰(Menges等，200相一致。有趣的是，有丝分裂性⑶KBl；1，而非CDKA；1，与RBR共纯化，这提供了进一步的证据，即E2F/DP/RBR网络不仅在G1/S处具有活性，在G2/M转变处也具有活性，这在植物(Magyar等，200或哺乳动物细胞(Ishidaetal.,2001)中先前曾有提示；或者，在酵母中，有丝分裂性CDK/细胞周期蛋白复合体在S-期过程中具有活性(Wuarin等，200。我们进一步鉴定了一些参与DNA复制的复合体，例如MCM复合体，其具有在DNA复制过程中负责使双链DNA解链的解旋酶活性。使用MCM6作为诱饵分离到了该复合体连同最近报道的(Takahashi等，2008)高度共表达的E2F-靶基因1(ETGl)。增殖细胞核抗原1(PCNAl)(其是DNA聚合酶的滑动钳且因此是DNA复制的关键作用物)的共纯化级份含有PCNA2、两种DNA聚合酶Δ亚单位(P0LD1-2)(其中之一还与CYCA2；3相互作用)、功能未知的犰狳蛋白/β-连环蛋白重复家族以及DNA结合蛋白。此外，我们证明植物中存在替代性CtflS复制因子C复合体(在酵母中其是姊妹染色单体粘合所必需的(Mayer等，2001))和在复制、修复和转录过程中参与单链DNA稳定化的蛋白复合体，其包括RPA2、两种RPA3蛋白和推定的复制蛋白(Schultz等，2007)。实施例9分析过表达株系采用Gateway克隆法将32种基因克隆进表达载体中，以产生在CaMV35S启动子控制下过表达感兴趣的基因的植物(表，产生的OE和请求的LOF页)。使用花浸法以这些构建体进行拟南芥转化。针对所有构建体选择第一代转化体并使之生长结籽。收获来自11种构建体(At5g2M60、At3g01280、Atlg31760、At3g21140、At3gl7020、Atlg05805、Atlgl0690、Atlg56110、At5gM690、At5g60790、Atlg09760)的种子，并用于选择具有一个插入转基因的位点的株系。在这些含有一个插入位点的分离群体上进行生物量测试。在这一群体中，预期会发现1/4的野生型(wt)植物、2/4的半合子植物和1/4的纯合子植物。当转基因的过表达导致产生更大的植物时，一部分(1/4或3/4)被研究的植物会显示出生物量增加。使用这种方法能够快速筛选出这样的基因，其过表达对植物生长产生正效应。然后将植物生长在体外条件下，并在分层(stratification)后20天测量大约60株植物的莲座丛鲜重(表，OE数据+平均值页)。用于本实验的对照植物相应于以空载体(Cl和C2)转化的分离植物。如图4所示，对于这两种独立的对照株系，植物的鲜重在8mg至^mg不等，平均20mg。在所分析的11个过表达株系中，我们发现5个株系(Atlg56110、At3gl7020、At3g21140、At5g25460、At5g60790)中的这种重量分布与对照相比向更大的植物偏移(图幻。在两个独立转化体的这些株系中，发现3个株系有这种生物量范围的偏移(图6)。在这一分离群体中存在更大的植物这一点证明，这5种基因参与对生长的调控。表1用于阐明拟南芥核心细胞周期相互作用组的诱饵蛋白的纵览拓扑学=C-端或N-端标记物融合体。标记物指的是所使用的标记物，其是为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)建立的常规TAP标记物(15)，或是优化的双亲和力标记物(GSM2)。如果能够以蛋白质印迹分析检测到TAP融合蛋白，则以(+)表示有表达。显示了每一诱饵进行的纯化总数，最少是两次实验。权利要求1.分离新的细胞周期相关蛋白的方法，包括(1)使用已知的细胞周期蛋白作为诱饵进行tap分析，(2)针对非特异性相互作用修正结果，和(3)对修正的结果进行再确认。2.用权利要求1的方法分离到的细胞周期相关蛋白在调节植物生长中的用途。3.权利要求2的细胞周期相关蛋白的用途，其中所述蛋白选自Atlg56110、At3gl7020、At3g21140、At5g25460、At5g60790、At4g38900、At3g49240、At5g24690、Atlg06070、At4g34150、Atlg20480、At5g20920、At3gl5970、At5gl3030、Atlg01880、At5g07310、At2g46610、Atlgl0690、At3g04710、At3g24690、At4gl6130、At2g05830、Atlg29220、Atlg55890、Atlg60650、Atlg70830、At2g43140、Atlg77180、At5gl8620、At5g02530、At5gl4170、Atlg52730、At2g33340、Atlg03060、At3g62240、At4g38740、At5g61220、At3g53880、At3g56860、Atlg01970、Atlgl9520、Atlgl4620、At2g03820、At3g01280、At3g56690、At5g41190、At5g03740、Atlg42440、At2g28450、Atlg09760、Atlgl0840、At3gll830、At5g54900、Atlg31760、Atlg61870、At3gll760、Atlg05805、Atlg29200、At4gl3850、At4g38780、Atlg71380、At3gl3640、At5g25060、Atlg43700、At2g46020、At3g55760和At5g21160或其变体。4.细胞周期相关蛋白用于促进植物生长的用途，其中所述蛋白选自Atlg56110、At3gl7020、At3g21140、At5g25460、At5g60790或其变体。5.权利要求4的细胞周期相关蛋白的用途，其中所述用途是过表达。6.权利要求4或5的用途，其中所述促进植物生长以植物生物量的增加来测量。7.权利要求2-6中任一项的用途，其中所述植物是农作物。8.权利要求7的用途，其中所述农作物是谷类。9.权利要求8的用途，其中所述谷类选自稻、玉蜀黍、小麦、大麦、粟、黑麦、高粱和燕麦。10.用权利要求1的方法分离到的新的细胞周期相关蛋白。全文摘要本发明涉及用于筛选涉及和/或参与植物细胞周期的蛋白质的新的方法。其还涉及用此方法分离的蛋白质以及这些蛋白质和/或编码这些蛋白质的基因在调节植物产量和植物生长中的用途。文档编号C12N15/82GK102333873SQ200980156546公开日2012年1月25日申请日期2009年12月10日优先权日2008年12月10日发明者D·G·因泽,E·威特斯,G·德耶格尔,H·范翁克伦,J·范莱内,N·冈萨雷斯申请人:安特卫普大学,弗拉芒区生物技术研究所,根特大学