一种删除转基因水稻筛选标记基因的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种可以 删除转基因植物筛选标记基因的方法。
【背景技术】
[0002] 在转基因植物中，导入植物体内的外源基因除了目的基因之外，还有筛选标记基 因及其他相关基因。目的基因是用来优化或赋予植物特定性状的基因；筛选标记基因则能 赋予转基因植株抗某种抗生素或除草剂等特性，在转基因过程中的使用可以大大提高转基 因植物筛选的效率。除了目的基因人们对转基因植物的担忧主要集中在筛选标记基因上， 尽管还没有确切的证据证实筛选标记基因确实存在安全隐患，但筛选标记基因的安全性问 题已受到世界各国政府和组织的重视，并已成为限制转基因植物产业化和商业化发展的主 要瓶颈。因此，如何删除筛选标记基因以提高转基因植物的安全性一直是基因工程研宄的 热点之一。
[0003] 长期以来，筛选标记基因及其产物是否会对环境或人类健康产生影响，引起了人 们广泛关注。为解决可能因选择标记引起的安全问题，一些科学家采用了较为安全的基因 作为选择标记，如6-磷酸甘露糖异构酶基因、木糖异构酶基因等。但这种替换策略仍未能 完全消除人们对筛选标记基因的安全性疑虑，从根本上讲，彻底删除转基因植物中的筛选 标记基因，培育无选择标记的转基因植物，才是解决选择标记安全性顾虑的最根本策略。因 此，无选择标记转基因植物的研宄和培育已成为国际上植物基因工程领域的一个趋势。目 前，应用于水稻系统中的分子删除系统效率比较低，且需要在组织培养阶段进行诱导处理， 不利于规模化操作。
【发明内容】
[0004] 鉴于此，本发明巧妙地、以本发明特有的方式利用CRISPR/Cas9系统介导的基因 组定点编辑技术建立了一个在植株水平上高效率删除转基因水稻筛选标记基因的方法。
[0005] 原理介绍
[0006] CRISPR/Cas是广泛存在于细菌或古生菌中的一种获得性免疫系统。CRISPR位点 是位于细菌染色体上或质粒上的一段特异DNA序列，由一系列短的高度保守的正向重复 序列和与之长度相似的间隔序列间隔排列组成。Cas9基因是与CRISPR重复序列相连的 保守的CRISPR相关蛋白基因。基于CRISPR/Cas9系统的特异识别切割特点，目前应用较 为成功的是经过改造的来自产脓链球菌的CRISPR/Cas9系统。Jinek等首次实现了基于 CRISPR/Cas9系统诱发的DNA双链断裂，为CRISPR/Cas9的进一步应用提供了基础。Cong 等首次利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞的EMX1以及小鼠细胞的Th实现了定点突变， 目前CRISPR/Cas9技术已成功应用于大肠杆菌、肺炎双球菌、斑马鱼、果幡和小鼠中。最 近，CRISPR/Cas9在植物中是应用也取得了重大突破，Li等利用CRISPR/Cas9在拟南芥和 烟草中也成功实现了基因组的定点突变，并发现突变效率与gRNA的表达量有关；同时证明 CRISPR/Cas9系统可同时对多基因或单基因的多个位点进行定点编辑。Nekrasov等利用 CRISPR/Cas9系统成功实现了烟草基因PDS的定点突变，突变率为1. 8% -2. 4%。
[0007] CRISPR作为一种新的靶向基因修饰技术，目前已经应用于水稻、小麦、拟南芥等基 因的定点修饰研宄中，但尚未有进行重要农作物目标农艺性状进行改良的研宄。
[0008] 考虑到CRISPR/Cas9技术特性，本发明巧妙地将其应用于转基因水稻筛选标记基 因的删除，实现了转基因水稻筛选标记基因的高效率删除。
[0009] 具体而言，本发明提供了一种在植株水平上高效率删除转基因水稻筛选标记基因 的方法，利用CRISPR/Cas9系统介导的基因组定点编辑技术，建立无筛选标记基因的水稻 转基因体系，为培育具生物安全的转基因水稻新品种提供一个新途径，为安全、高效的水稻 转基因育种提供基础。本发明可以用于删除转基因水稻基因或其片段中的筛选标记基因， 下文中也可以将这样的基因或片段称为原载体。
[0010] 进一步地，所述方法包括以下步骤：
[0011] 1)在水稻筛选标记基因所转入的原载体中标记基因编码框上游序列区选取第一 靶标片段，并且在标记基因编码框下游序列选取第二靶标片段，所述第一和第二靶标片段 的一条链均具有5'-(N) x-NGG-3'结构，其中（N)x表示数目为X的一条碱基序列{Ni，N2…… Nx} ,N!，N2......Nx中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中N为碱基A、G、C、T中 的任意一个；
[0012] 2)按照所述第一和第二靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻基因打靶的 CRISPR/Cas9重组载体，所述重组载体包括具有所述靶标片段的向导RNA表达框以及Cas9 核酸酶表达框；
[0013] 3)制备含有所述筛选标记基因的转基因水稻的愈伤组织，备用；
[0014] 4)将步骤2)所获得的重组载体导入步骤3)中获得的愈伤组织中的水稻细胞，诱 导所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，对待删除 的标记基因编码框启动子上游及终止子下游的区域实现同时剪切，造成双链断裂。同时触 发水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点造成缺失碱基，实现细胞内筛选标记基因、上 游启动子及下游终止子的片段缺失；
[0015] 5)通过原生质体瞬时转化或农杆菌介导的稳定转化获得再生植株，通过基因组 PCR方法克隆再生植株中含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序。
[0016] 6)选择筛选标记基因编码框完全缺失的转基因植株。
[0017] 在一种优选实现方式中，所述第一靶标片段中5' _(N)x-NGG-3'结构的X的数值与 所述第二靶标片段中5' _(N)x-NGG-3'结构的X的数值彼此不同，在另一种实现方式中，二 者彼此相同。
[0018] 在一种优选实现方式中，X为19或20。
[0019] 在一种优选实现方式中，用于水稻基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，为双靶点 重组载体。
[0020] 在一种优选实现方式中，所述第一靶标片段位于驱动筛选标记基因表达的启动子 的上游，序列为5 '-GTGGACGAGATTAGATAGCC-3 '，原载体可以用于组装其它高效位点特异性 识别序列。
[0021] 在一种优选实现方式中，所述第二靶标片段位于终止筛选标记基因表达的终止子 的下游，序列为5'-TAGCCCTGCAGGAAATTTAC-3 '，原载体可以用于组装其它高效位点特异性 识别序列。
[0022] 在一种优选实现方式中，原载体中含有报告基因GUS，原载体可以用于组装具有特 定功能的基因。
[0023] 在一种优选实现方式中，所述筛选标记基因指潮霉素基因、抗除草剂基因、木糖异 构酶基因、抗生素抗性基因等。
[0024] 在一种优选实现方式中，所述具有特定功能的基因指抗虫基因、抗病基因、抗除草 剂基因、抗逆基因、抗衰老基因、品质功能改良基因以及由上述基因组成的融合或多价基 因。
[0025] 在一种优选实现方式中，所述水稻是指籼稻和粳稻。
[0026] 在上述方法的具体实现过程中，本发明利用载体PCAMBIA1300,获得带有筛选标记 基因的日本晴转基因植株。
[0027] 另一方面，本发明还提供一种用于水稻基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，所述 载体含有骨架载体、靶标片段1和靶标片段2。
[0028] 优选地，第一靶标片段的核苷酸序列为5' -GTGGACGAGATTAGATAGCC-3'，第二靶标 片段的核苷酸序列为5' -GTAAATTTCCTGCAGGGCTA-3'。所述第一靶标片段位于筛选标记基 因启动子的上游区域，第二靶标片段位于筛选标记基因终止子下游区域；优选地，靶标片段 靠近启动子或终止子区域，且为非水稻基因组序列或同源序列。
[0029] 本发明将上述重组载体导入含有筛选标记基因的水稻细胞中，通过细胞再生若干 水稻植株。将重组载体导入水稻细胞的方法为PEG介导的水稻原生质体瞬时转化或农杆菌 介导的水稻愈伤组织稳定转化。并且，本发明通过基因组PCR方法克隆再生植株中含靶标 片段的DNA区段，并对扩增