群体的新策略的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于玉米基因图位克隆领域，具体涉及一种玉米单基因精细定位时高效筛选F2群体和BC1F1群体的新策略。
【背景技术】
[0002]基因定位是在明确突变表型的前提下，利用分子标记将突变基因精确定位在染色体的某一位置上。目的基因的精细定位是最艰苦也是最耗时的限速步骤。利用突变体和野生型个体杂交构建有效的分离群体(F2或BC1F1群体)是基因精细定位的首要条件，定位群体越大，在粗定位区段内获得的交换单株越多，就越利于基因的精细定位。所以，构建足够大的定位群体是基因精细定位的重要保障。尤其对于玉米来说，因为玉米基因组非常大(2300Mb，是拟南芥基因组的20倍，是水稻基因组的5倍，是高粱基因组的3.5倍)且富含重复序列(85%的碱基是重复序列)，所以玉米的基因组结构非常复杂，构建和筛选足够大的分离群体对玉米基因的精细定位更为重要。
[0003]对于玉米基因的精细定位，传统的方法是先鉴定单株表型再用分子标记(M)鉴定单株基因型，首先基于已构建的F2和BC1F1分离群体(群体构建策略见图1)，在大田中大面积种植定位群体，等到植株成熟后鉴定单株表型。通过分析F1R配子的基因型(图2)，得到F2群体和BC1F1群体的基因型分布(图3A，图4A)。然后，将单株的表型和基因型对应起来，选出群体中的交换单株(图3A，图4A)。这种策略需要我们在大田中大面积种植定位群体，待植株成熟后再鉴定表型，这期间需要消耗大量的人力、物力和财力，而且由于旱涝灾害、大风、病害等环境条件不可控，极易造成植株的大量损失而无法获得预期的群体规模，存在较大风险。
[0004]另外，对几万单株的大群体进行表型鉴定，工作量巨大而且很容易导致表型鉴定错误。尤其是对于玉米雄性育性的鉴定，由于玉米雄穗的花粉成熟及散粉都发生在较短的时期内，这就要求我们在几天内完成几万单株的育性鉴定，这样就很难保证表型鉴定的准确性。而且，由于大群体内单株的发育时期参差不齐，很难避免因表型鉴定时期不合理而导致的表型鉴定失败。
【发明内容】
[0005]为应对玉米基因精细定位传统策略中存在的难题，本发明提供一种高效筛选F2和BC1F1大群体的新策略，该策略先通过鉴定单株基因型筛选出交换单株，然后再鉴定交换单株的表型。该策略只需培育交换单株，省去了大规模培育几万株群体所需的大量人力、物力和财力；更重要的是，该策略只对交换单株进行表型鉴定，不仅省去了对几万单株的大群体进行表型鉴定所需的巨大工作量，还能提高表型鉴定的准确性。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:首先基于已构建的F2和BC1F1分离群体(群体构建策略见图1)，在温室对定位群体进行高密度育苗并对幼苗进行编号，然后取幼苗叶片提取基因组DNA用于基因型鉴定。下一步，基于目的基因(G)粗定位的结果，在粗定位区间两端各选一个共显性分子标记(A、B)，对每个单株进行基因型鉴定。根据匕代配子的基因型(图2)，分析得到F2和BC1F1群体的基因型分布(图3B、图4B)。根据单株的基因型鉴定结果，结合F2和BC1F1群体中交换单株的基因型(图3B和图4B中加粗部分所示的基因型为交换单株)，挑出群体中的交换单株，将其幼苗移栽至大田继续培育，然后根据突变性状的特点选取合适的时机对交换单株进行表型鉴定。最后，将交换单株的表型和基因型对应起来(参照图3B、图4B)，判断该交换单株发生交换的方向，继而利用筛选出的交换单株对目的基因进彳丁进一步精细定位。
[0007]本发明的有益效果是，不需要在大田中大规模培育几万株群体，不需要对几万单株的群体进行表型鉴定，可以节省大量的人力、物力、财力，还能提高表型鉴定的准确性。另外，无论是F2群体还是BC1F1群体，该发明的新策略与传统方法中鉴定出交换单株的比率相当，所以该发明对鉴定出交换单株的比率并无影响。
【附图说明】
[0008]图中PpP2是亲本，G是目的基因，A、B、M是分子标记；F指可育表型，S指不育表型；X、y代表分子标记A/M、B与目的基因G之间的交换率。
[0009]图1A:玉米核不育基因定位时配制F2群体的系谱图。
[0010]图1B:玉米核不育基因定位时配制BC1F1群体的系谱图。
[0011]图2:玉米核不育基因定位时F1代配子的基因型。F1代植株雌雄配子的形成过程中，目的基因位点可能与其左右侧分子标记不发生交换，也可能与其左侧分子标记位点A或右侧分子标记位点B发生交换，也可能同时与A和B位点发生交换产生双交换。所以，F1代共可产生8种基因型的配子,分别是AGB, agb, aGB, Agb, AGb, agB, AgB, aGb。
[0012]图3A:利用F2群体进行玉米核不育基因精细定位的传统策略。传统方法先鉴定表型再鉴定基因型，最先获得的是F2单株的表型。可育表型[F(GG)和F(Gg)]中既包含亲型非交换单株丽和Mm，也包含交换单株丽和Mm，所以无法将丽和Mm基因型的交换单株挑出来，仅可挑出mm基因型的交换单株；不育单株S(gg)中，mm基因型为亲本型，丽和Mm基因型为交换单株。综上，F2群体可挑出交换单株的比率为x(2-x)/2,又因为基因精细定位时可忽略比率非常小(约1/106)的双交换，故匕群体总体可挑出交换单株的比率约为X。
[0013]图3B:利用本发明高效筛选玉米F2群体的新策略。
[0014]AABB基因型:F—包括亲本型和双交换单株，无法区分；S—仅含双交换单株，挑出；
[0015]AaBb基因型:F—包括亲本型、左交换、右交换和双交换单株，无法区分；S—仅含双交换单株，挑出；
[0016]AaBB基因型:F—包括左交换、右交换和双交换单株，无法区分；S—仅包括双交换单株，挑出；
[0017]AABb基因型:F—包括左交换、右交换和双交换单株，无法区分；S—仅包括双交换单株，挑出；
[0018]aabb基因型:F—仅包括双交换单株，挑出；S—仅包括亲本型单株；
[0019]aaBb基因型:F—包括左交换和双交换单株，无法区分；S—仅包括右交换单株，挑出；
[0020]Aabb基因型:F—包括右交换和双交换单株，无法区分；S—仅包括左交换单株，挑出；
[0021]aaBB基因型:F—包括左交换、右交换和双交换单株，无法区分；S—仅包括右交换单株，挑出；
[0022]AAbb基因型:F—包括右交换和双交换单株，无法区分；S—仅包括左交换单株，挑出。
[0023]该发明可挑出交换单株的比率为(1-x-y_2xy) x/2+ (1-x-y_2xy) y/2,可忽略比率极小(约1/106)的双交换，故该新策略获得的交换单株比率约为X，与传统方法获得的交换单株比率相当。
[0024]图4A:利用BC1F1群体进行玉米核不育基因精细定位的传统策略。传统方法先鉴定表型再鉴定基因型，最先获得的是BC1F1单株的表型。可育单株(F)中，非交换单株(Mm)比率为1-x，交换单株(mm)比率为X ;不育单株(S)中，非交换单株(mm)比率为l_x,交换单株(Mm)比率为X。最终可挑出交换单株的比率为X。
[0025]图4B:利用本发明高效筛选玉米BC1F1群体的新策略。
[0026]AaBb基因型:为亲本型，即非交换单株，不移栽，弃去；
[0027]aabb基因型:为亲本型，即非交换单株，不移栽，弃去；
[0028]aaBb基因型:挑出移栽大田，待植株成熟鉴定育性，若为可育(F)则为A、G交换单株，若为不育⑶则为B、G交换单株；
[0029]Aabb基因型:挑出移栽大田，待植株成熟鉴定育性，若为可育(F)则为B、G交换单株，若为不育(S)则为A、G交换单株。
[0030]与传统方法相比，该发明只漏掉了双交换单株，又双交换的比率仅为2X (l-X-y-2Xy)Xy，约为1/106，故可忽略因弃去双交换单株对基因精细定位的影响。所以，该发明并未影响从BC1F1群体中挑出交换单株的比率。
【具体实施方式】
[0031]下面以玉米核雄性不育基因(隐性单基因)的精细定位为例，结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0032]I)温室育苗:在温室内高密度种植匕或此芯群体，待出苗后对单株进行挂牌标记，同时取单株的叶片提取基因组总DNA ；
[0033]2)在目的基因粗定位区间的两端分别选一个共显性分子标记，以单株DNA为模板，以分子标记为引物，PCR扩增鉴定单株的基因型；
[0034]3)根据本发明中分析的匕和此芯群体中交换单株的基因型(图4A、图4B)，挑出交换单株；
[0035]4)将交换单株幼苗移栽到大田，培育至成熟期鉴定其雄性育性；
[0036]5)将交换单株的表型和基因型对应起来，根据图4A和图4B的分析结果，确定交换单株发生交换的方向。
【主权项】
1.一种玉米单基因精细定位时高效筛选F2群体和BC1F1群体的新策略，其特征是: 1)温室高密度育苗，编号并提取DNA； 2)在目的基因粗定位区间的两端分别选一个共显性分子标记，鉴定单株的基因型； 3)根据单株的基因型，挑出交换单株并将交换单株幼苗移栽到大田，培育至成熟期鉴定其表型； 4)将交换单株的表型和基因型对应起来，确定交换单株所发生的交换的方向； 5)适用于已知粗定位区段的玉米显性、隐性单基因的精细定位。
【专利摘要】一种玉米单基因精细定位时高效筛选F2群体和BC1F1群体的新策略。该策略先在温室高密度育苗，然后基于目的基因的粗定位结果，在粗定位区间两端各选一个共显性分子标记，对单株进行基因型鉴定。根据基因型鉴定结果选出交换单株，将交换单株移栽至大田继续培育，适时进行表型鉴定。最后，将交换单株的基因型和表型对应起来，判断该交换单株发生交换的方向，继而对目的基因进一步精细定位。本发明用于玉米单基因的精细定位，筛选出交换单株的比率与常规方法相当，而且不需要在大田中大规模培育几万株定位群体，也不需要对几万单株的定位群体进行表型鉴定，不仅节省大量的人力、物力、财力，还能提高表型鉴定的准确性。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105219838
【申请号】CN201410261970
【发明人】田有辉, 刘娟, 陈化榜
【申请人】田有辉, 刘娟, 陈化榜
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2014年6月13日