多浪羊snp标记及其筛选方法与应用
【专利摘要】本发明公开了多浪羊SNP标记及其筛选方法与应用，属于动物分子标记领域。本发明通过遗传分化系数方法从商业化绵羊基因组SNP芯片中筛选并进一步通过连锁不平衡分析剔除强连锁不平衡的SNP标记(r2>0.2)，从而获得本发明多浪羊SNP标记。本发明所述多浪羊SNP标记能够应用于多浪羊品种或其畜产品的鉴定且标记间不存在显著的连锁不平衡，因此，在应用本发明所述的多浪羊SNP标记对多浪羊品种或其畜产品进行鉴定时，无位点之间的干扰，大大提高了多浪羊品种鉴定的准确性，并有效降低了鉴定成本。
【专利说明】
多浪羊snp^HH及其筛选方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于动物分子标记领域，具体设及多浪羊SNP标记及其筛选方法与应用。
【背景技术】
[0002] 目前对于绵羊的品种鉴定工作主要依赖于表型性状的测定和分析。随着杂交育种 的推广，一方面，高代杂交群体的个体表型与亲本的高度相似，无法利用表型性状进行区 分；另一方面，动物产品已经不能再表现出品种的表型特征，也无法利用表型性状进行鉴 另IJ。因此，单纯利用表型性状特征进行品种资源的鉴定不够准确、全面和科学。
[0003] DNA分子遗传标记问世为克服运一难题提供了有效的解决途径。DNA分子遗传标记 由于不受表型，时空限制、多态性好等特点，常常被用来进行此项工作。其中，最常用的DNA 分子标记是微卫星标记和SNP标记。
[0004] 微卫星标记被首先用于进行个体鉴定，其缺点是由于不同实验室的条件不同而难 W实现标准化和规模化。相反，SNP标记由于其广泛分布，并且开发了相应的高通量检测技 术平台，有利于实现检测和分析的标准化和规模化，进而被广泛应用。
[0005] 近年来，基于绵羊全基因组序列，开发了绵羊Ovine 50K Beadchip和Ovine皿 Beadchip的SNP忍片，其中50KSNP忍片已被广泛用于绵羊品种的遗传结构分析、全基因选择 信号分析、全基因关联分析和绵羊的品种鉴定。然而由于SNP忍片中无关位点的干扰，降低 了其进行绵羊品种鉴定的准确性，同时忍片检测分析高成本也极大地制约了其在绵羊及其 畜产品遗传种质的鉴定中规模化的推广和应用。
【发明内容】
[0006] 多浪羊是新疆的一种优良肉脂兼用型绵羊品种，因其中屯、产区在麦盖提县故又称 麦盖提羊，是新疆的地理标志产品之一。多浪羊体大、产肉多、肉质鲜嫩，被毛含绒毛多，毛 质较好，繁殖率高，具有早熟性，是组织黑羊肉生产的理想品种。
[0007] 本发明的目的之一在于提供多浪羊SNP标记，能够用于多浪羊品种或其畜产品的 鉴定，且准确性高、成本低。
[000引为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0009] 本发明通过遗传分化系数方法从商业化绵羊基因组SNP忍片（即：绵羊全基因组 50KSNP忍片）中筛选并进一步通过连锁不平衡分析剔除掉强连锁不平衡的SNP标记（即r2〉 0.2的SNP标记，其中:r为各SNP位点与LS化值最大的SNP位点的距离），从而获得本发明多浪 羊SNP标记。具体的所述标记为：S24380.1、0AR10_29469450.1、0AR25_10264608.1、 DU490596_503.1、0AR17_5388531.1、0AR13_51886803.1 中的一种或几种。
[0010]本发明所述SNP标记的位点的物理位置是基于绵羊V3.1基因组测序序列确定的， 所述多浪羊SNP标记的LS化值是基于绵羊个体间的遗传分化系数确定的。
[00川本发明进一步公开了多浪羊SNP标记的筛选方法，包括W下步骤：
[0012] (1)利用商业化基因组试剂盒(天根生化北京科技有限公司）提取待测绵羊样品基 因组DM:随机挑选多个包含多浪羊的绵羊样品个体，并对挑选出的绵羊样品基因组DM进 行提取；
[0013] (2)对绵羊全基因组50KSNP忍片的基因型进行分析:利用绵羊全基因组50KSNP忍 片基因型分析方法，对所述步骤（1)中挑选出的绵羊样品个体及其SNP进行质量控制，明确 挑选出的绵羊样品的品种；
[0014] (3)利用待测样品间的LSDLQo州s-specific branch lengths)值筛选出用于多 浪羊品种鉴定的SNP标记:从不同品种的绵羊样品中随机选取样品个体作为参考群体，通过 遗传分化系数方法，得到多浪羊每个SNP位点的LS化值，根据得到的多浪羊每个SNP位点的 LSDL值的大小从高到低进行排序，从排序靠前的SNP位点开始进行多浪羊SNP标记的筛选；
[0015] (4)对用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记进行验证:利用对数似然比率的 方法（log-1 ikel化ood ratios,化R)进行个体鉴定，从而验证用于多浪羊品种或其畜产品 鉴定的SNP标记。
[0016] 本发明更进一步地公开了上述步骤(3)中所述的从得到的多浪羊每个SNP位点的 LSDL值大小由高到低的排序中选择排序靠前的SNP位点进行多浪羊SNP标记的筛选的具体 步骤为：
[0017] S1:从得到的多浪羊每个SNP位点的LS化值大小由高到低的排序中挑选出LS化值 排名前30位的多浪羊SNP位点；
[0018] S2:对相同染色体上的SNP位点的连锁不平衡进行分析，基于从所述步骤S1中挑选 出的LSDL值排名前30位的多浪羊SNP位点及其最大LSDL值的多浪羊SNP位点，剔除强连锁不 平衡的SNP位点；
[0019] S3:将没有进行连锁不平衡分析的SNP位点与步骤S2中筛选得到的SNP位点，重新 根据LS化值的大小从高到底进行排序；
[0020] S4:按照步骤S3中SNP位点的排序，从排序靠前的SNP位点开始进行多浪羊SNP标记 的筛选，至少挑选出LSDL值排名前3位的多浪羊SNP位点作为所得多浪羊SNP标记。
[0021] 本发明更进一步地公开了上述步骤(4)中所述利用对数似然比率的方法进行个体 鉴定，从而验证用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记的具体步骤为：
[0022] D1:计算出不同品种的绵羊样品在筛选出的用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的 SNP位点上的每个等位基因频率，进而计算出每个基因型的理论频率，如一个等位基因频率 为P，则另外一个等位基因频率为1-P，相对应的Ξ种基因型的理论频率分别为P2、2p(l-P) 和（1-P)2;
[0023] D2:计算出每个绵羊样品个体分别为不同品种绵羊样品的可能性；
[0024] D3:根据步骤D2中得到的每个绵羊样品个体分别为不同品种绵羊样品的可能性， 利用对数似然比率的方法对筛选出的用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记进行验 证。
[0025] 本发明进一步公开了用于检测所述多浪羊SNP标记的引物对。根据本发明所述多 浪羊SNP位点对应序列即可设计正向引物和反向引物。引物设计原则为本领域技术人员所 熟知。
[0026] 本发明所述的多浪羊SNP标记应用于多浪羊品种或其畜产品鉴定中，包括W下步 骤：
[0027] (1)提取待测绵羊样品的基因组DM;
[0028] (2)利用上述引物对，W步骤（1)提取的基因组DM为模板，进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物；
[0029] (3)对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果；
[0030] (4)根据测序结果确定待测绵羊样品在所述SNP标记的基因型；
[0031] (5)利用对数似然比率的方法进行鉴定，比较多浪羊与待测样品的对数似然比率 值的大小，对数似然比率大于零的则鉴定为多浪羊品种或其畜产品；反之，则鉴定为不是多 浪羊品种或其畜产品。
[0032] 本发明技术方案与现有技术相比，具有W下有益效果：
[0033] 本发明所述多浪羊SNP标记能够应用于多浪羊品种或其畜产品的鉴定，在应用本 发明所述的多浪羊SNP标记对多浪羊品种或其畜产品进行鉴定时，克服了表型鉴定的缺陷， 简单易行，且无位点间的干扰，大大提高了多浪羊品种或其畜产品鉴定的准确性并有效降 低了成本。
【具体实施方式】
[0034] 下文将结合具体实施例进一步详细描述本发明。应当注意的是，下述实施例中描 述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可W被相互组合从而达到 更好的技术效果。本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例 仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离 本发明的精神和范围下可W对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但运些修改 或替换均落入本发明的保护范围。
[0035] 实施例1
[0036] 本实施例提供了一种在阿勒泰羊和己音布鲁克羊中筛选多浪羊SNP标记的方法， 包括如下步骤：
[0037] (1)选取108只包含阿勒泰羊、己音布鲁克羊和多浪羊的绵羊样品个体，采集运些 绵羊的血液，使用肝素纳抗凝，采取天根血液基因组试剂盒提取基因组DNA，0.8%琼脂糖凝 胶电泳检测，核酸蛋白定量仪测定其浓度和纯度，稀释至l(K)ng/ul，保存备用。
[003引 （2)将制备好的DNA样品，进行绵羊全基因组50K SNP忍片（illumina Ovine 50K BeadcMp)基因型分析，对得到的108个个体和54 241个SNP用Plink软件进行质量控制:个 体检出率（call rate)〉0.9，SNP检出率〉0.9，最小等位基因频率(MAF)〉0.01，哈伯格平衡 (HWE)〉0.000001。由于其中一只羊个体检出率小于0.9,经过质控后，所W最后剩余107个个 体，包括34只阿勒泰羊(ALT), 34只己音布鲁克羊(BY)和39只多浪羊(DL)，用于分析。
[0039] (3)随机选择24只阿勒泰羊，24只己音布鲁克羊和29只多浪羊作为参考群体，利用 Popgene软件分别计算多浪羊与阿勒泰羊、多浪羊与己音布鲁克羊的、阿勒泰羊与己音布鲁 克羊的遗传分化系数(Pair Fst)，多浪羊与阿勒泰羊的遗传分化系数设为FSTdlby，多浪羊 与己音布鲁克羊的遗传分化系数为FSTdlalt，阿勒泰羊与己音布鲁克羊的遗传分化系数为 FSTbyalt。计算每个品种的每个位点的locus-specific branch lengths,即：LSDL值，对于多 浪羊的LSDL化计算公式则为：LSDL化=(FSTdlby+FSTdlalt-FSTbyalt)/2,挑选出多浪羊LSDL值排 名前30位的SNP位点，详见表1，用于下一步个体鉴定。
[0040]表1多浪羊，阿勒泰羊和己音布鲁羊的LS化值
[0041]
[0042] 挑选出的SNP位点大部分都位于2号染色体上，利用化ploview对多浪羊参考群体 中挑选出的位点的连锁不平衡进行分析，获得S24380.1与其他各个SNP位点之间距离的平 方值r2,如表2所示，剔除掉r2〉0.2的相关位点，最终2号染色体上仅保留了 S24380.1、 S61605.1、s53985.1、0AR2_57729090.1、0AR2_58107393.1 和0AR2_61592242.1运6 个位点。
[0043] 表2 S24380.1与各个SNP位点之间的距离平方值
[0044]
[0045] 将剩余的没有进行连锁不平衡分析得SNP位点的LS化值排序，挑选出LS化值最高 的3个SNP位点：S24380.1、0AR10_29469450.1 和0AR25_10264608.1。
[0046] (4)分别计算出巧中绵羊的运3个位点的每个等位基因的频率，然后推算出每个基 因型频率，如表3所示。
[0047] 表3Ξ个绵羊品种Ξ个位点可能的基因型频率 [004引
[0049] 选取10只阿勒泰羊，10只己音布鲁克羊和10只多浪羊作为待鉴定个体，计算每个 个体每个SNP位点基因型属于每个品种的可能性：
[0050] 首先，假设每个个体均为多浪羊，W检测个体AL503为例，在S24380.1位点的基因 型为 AG，多浪羊的可能性则为 LogioO. 2378，在 0AR10_29469450.1 位点和 0AR25_10264608.1 位点的基因型分别为AG和AA，其为多浪羊的可能性分别为Logio0.0 339和Logio0.0 360。该个 体为多浪羊的可能性为Logi〇TDL3 = Logi〇0.2378+Logio0.0 339+Logio0.0 360 = -3.54，其他待 检测个体详见表4;其次，假设每个个体均为阿勒泰羊，同样的方法计算每个个体为阿勒泰 羊的可能性LogioTAm，详见表5。再次，假设每个个体均为己音布鲁克羊，同样的方法计算每 个个体为己音布鲁克羊的可能性Logi〇TBY3，详见表6。
[0051 ]表4基于Ξ个位点计算待检测个体为多浪羊可能性LoglOTOLS
[0057]表6基于Ξ个位点计算待检测个体为己音布鲁克羊可能性LoglOTBYS [0化引
[0059] 利用对数似然比率的方法]XR(log-likelihood ratios)鉴别个体，具体计算公式 为lXRi = LoglOTDL3-LoglOTALT3，LLR2 = LoglOTDL3-LoglOTBY3,多浪羊与阿勒泰羊或者己 音布鲁克羊的化R值相减大于0时，个体是多浪羊而不是阿勒泰羊或者己音布鲁克羊，利用 该方法对待检测的个体进行鉴定，对于多浪羊的鉴定的准确性均达到了 100%，见表7。至此 我们鉴别出3个有效SNP标记用于阿勒泰羊，己音布鲁克羊和多浪羊混杂群体中的多浪羊个 体或者产品的鉴定。
[0060] 表7基于Ξ个位点计算检测多浪羊
[0061]
[0062]续表7基于Ξ个位点计算检测多浪羊
[0063]
[0064] 实施例2
[0065] 本实施例提供了一种在德国肉用美利奴和中国美利奴羊中筛选多浪羊SNP标记的 方法，包括如下步骤：
[0066] (1)选取159只包含德国肉用美利奴、中国美利奴羊和多浪羊的绵羊个体样品，采 集运些绵羊的血液，使用肝素纳抗凝，采取天根血液基因组试剂盒提取基因组DNA，0.8%琼 脂糖凝胶电泳检测，核酸蛋白定量仪测定其浓度和纯度，稀释至l(K)ng/ul，保存备用。
[0067] (2)将制备好的DNA样品，进行绵羊全基因组50K SNP忍片（illumina Ovine 50K BeadcMp)基因型分析，对得到的159个个体的54 241个SNP用PI ink软件进行质量控制:个 体检出率（call rate)〉0.9，SNP检出率〉0.9，最小等位基因频率(MAF)〉0.01，哈伯格平衡 化胖6)〉0.000001。经过质控后，包括60只德国肉用美利奴(611)，60只中国美利奴羊化1)和 39只多浪羊(DL)，用于分析。
[0068] (3)随机选择50只德国肉用美利奴，50只中国美利奴和29只多浪羊作为参考群体， 利用Gene化P软件分别计算德国肉用美利奴与多浪羊、多浪羊与中国美利奴、德国肉用美利 奴与中国美利奴羊的遗传分化系数(Pair Fst)，多浪羊与中国美利奴的遗传分化系数设为 FSTdlcm，多浪羊与德国肉用美利奴的遗传分化系数为FSTdlgmm，中国美利奴与德国美利奴的 遗传分化系数为FSTbyalt。计算每个品种的每个位点的locus-specific branch lengths, 良P :LSDL值，对于多浪羊的LSDL化计算公式则为:LSDLdl= (FSTdlcm+FSTdlgmm-FSTcmgmm)/2，挑选 出多浪羊LS化值排名前30位的SNP位点，详见表8,用于下一步个体鉴定。
[0069] 表8多浪羊，德国肉用美利奴和中国美利奴的LS化值
[0070]
[0071 ]挑选出LSDL值最高的3个SNP位点：DU490596_503.1、0AR17_5388531.1和0AR13_ 51886803.1。由于运Ξ个SNP位点分别位于不同的染色体上，因此不考虑连锁不平衡的问 题。
[0072] (4)分别计算出巧中绵羊的运3个位点的每个等位基因的频率，然后推算出每个基 因型频率，如表9所示。
[0073] 表9Ξ个绵羊品种Ξ个位点理论上的基因型频率
[0074]
[0075] 选取10只多浪羊，10只德国肉用美利奴和10只中国美利奴作为待鉴定个体，计算 每个个体每个SNP位点基因型属于每个品种的可能性。具体计算方法同实施例1，结果详见 表10、表11、表12。
[0076] 表10基于Ξ个位点计算待检测个体为多浪羊可能性LoglOTOLS
[0080]续表11基于Ξ个位点计算待检测个体为德国肉用美利奴羊可能性LoglOTDMMS
[00化]利用对数似然比率的方法化R(log-likelihood ratios)鉴别个体，具体计算公式 为化虹=1^旨10了化3-1^旨10了6113，化1?2 = 1^旨10了化3-1^旨101^13，多浪羊与德国肉用美利奴 或者中国美利奴羊的LLR值相减大于0时，个体是多浪羊而不是德国肉用美利奴或者中国美 利奴羊，利用该方法对待检测的个体进行鉴定，对于多浪羊的鉴定的准确性均达到了 100%，见表13。至此我们鉴别出3个有效SNP标记用于德国肉用美利奴、中国美利奴羊和多 浪羊混杂群体中的多浪羊个体或者产品的鉴定。
[0087]表13基于Ξ个位点计算检测多浪羊
[008引
[0089] 实施例3
[0090] 本发明的鉴定方法与现有鉴定多浪羊方法的比较，见表14。
[0091] 表14本发明的鉴定方法与现有鉴定多浪羊方法的比较
[0092]
[0093] 本发明所述多浪羊SNP标记能够应用于多浪羊品种或其畜产品的鉴定，在应用本 发明所述的多浪羊SNP标记对多浪羊品种或其畜产品进行鉴定时，克服了表型鉴定的缺陷， 简单易行，且无位点间的干扰，大大提高了多浪羊品种或其畜产品鉴定的准确性并有效降 低了成本。
【主权项】
1. 多浪羊SNP标记，其特征在于，所述SNP标记是从商业化绵羊基因组SNP芯片中筛选并 通过连锁不平衡分析剔除强连锁不平衡的SNP标记得到，具体包括：s24380.1、0AR10_ 29469450·1、0AR25_10264608·1、DU490596_503·1、0AR17_5388531·1、0AR13_51886803·1中 的一种或几种。2. 如权利要求1所述的多浪羊SNP标记，其特征在于，所述商业化绵羊基因组SNP芯片为 绵羊全基因组50KSNP芯片，所述强连锁不平衡的SNP标记为r 2>0.2的SNP标记。3. 如权利要求2所述的多浪羊SNP标记，其特征在于，所述SNP标记的位点的物理位置是 基于绵羊V3.1基因组测序序列确定的，所述多浪羊SNP标记的LSDL值是基于绵羊个体间的 遗传分化系数确定的。4. 一种如权利要求1-3任一项所述的多浪羊SNP标记的筛选方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 利用商业化基因组试剂盒提取待测绵羊样品基因组DNA; (2) 对绵羊全基因组50KSNP芯片的基因型进行分析； (3) 利用待测样品间的LSDL值筛选出用于多浪羊品种鉴定的SNP标记； (4) 对用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记进行验证。5. 如权利要求4所述的多浪羊SNP标记的筛选方法，其特征在于，具体包括以下步骤： (1) 随机挑选多个包含多浪羊的绵羊样品个体，并对挑选出的绵羊样品基因组DNA进行 提取； (2) 利用绵羊全基因组50KSNP芯片基因型分析方法，对所述步骤（1)中挑选出的绵羊样 品个体及其SNP进行质量控制，明确挑选出的绵羊样品的品种； (3) 从不同品种的绵羊样品中随机选取样品个体作为参考群体，通过遗传分化系数方 法，得到多浪羊每个SNP位点的LSDL值，根据得到的多浪羊每个SNP位点的LSDL值的大小从 高到低进行排序，从排序靠前的SNP位点开始进行多浪羊SNP标记的筛选； (4) 利用对数似然比率的方法进行个体鉴定，从而验证用于多浪羊品种或其畜产品鉴 定的SNP标记。6. 如权利要求5所述的多浪羊SNP标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤(3)中所述从 得到的多浪羊每个SNP位点的LSDL值大小由高到低的排序中选择排序靠前的SNP位点进行 多浪羊SNP标记的筛选的具体步骤为： S1:从得到的多浪羊每个SNP位点的LSDL值大小由高到低的排序中挑选出LSDL值排名 前30位的多浪羊SNP位点； S2:对相同染色体上的SNP位点的连锁不平衡进行分析，基于从所述步骤S1中挑选出的 LSDL值排名前30位的多浪羊SNP位点及其最大LSDL值的多浪羊SNP位点，剔除强连锁不平衡 的SNP位点； S3 :将没有进行连锁不平衡分析的SNP位点与步骤S2中筛选得到的SNP位点，重新根据 LSDL值的大小从高到底进行排序； S4:按照步骤S3中SNP位点的排序，从排序靠前的SNP位点开始进行多浪羊SNP标记的筛 选，至少挑选出LSDL值排名前3位的多浪羊SNP位点作为所得多浪羊SNP标记。7. 如权利要求5所述的多浪羊SNP标记的筛选方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述利 用对数似然比率的方法进行个体鉴定，从而验证用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标 记的具体步骤为： D1:计算出不同品种的绵羊样品在筛选出的用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP位 点上的每个等位基因频率，进而计算出每个基因型的理论频率； D2:计算出每个绵羊样品个体分别为不同品种绵羊样品的可能性； D3:根据步骤D2中得到的每个绵羊样品个体分别为不同品种绵羊样品的可能性，利用 对数似然比率的方法对筛选出的用于多浪羊品种或其畜产品鉴定的SNP标记进行验证。8. 用于检测如权利要求1所述的多浪羊SNP标记的引物对。9. 如权利要求1所述的多浪羊SNP标记在多浪羊品种或其畜产品鉴定中的应用。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取待测绵羊样品的基因组DNA; (2) 利用权利要求6所述的引物对，以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物； (3) 对所述PCR扩增产物进行测序，获得测序结果； (4) 根据测序结果确定待测绵羊样品在所述SNP标记的基因型； (5) 利用对数似然比率的方法进行鉴定，比较多浪羊与待测样品的对数似然比率值的 大小，对数似然比率大于零的则鉴定为多浪羊品种或其畜产品；反之，则鉴定为不是多浪羊 品种或其畜产品。
【文档编号】C12Q1/68GK106011259SQ201610491006
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】李文蓉, 贺三刚, 刘明军, 陈磊, 韩冰, 玛依拉, 蒋晓梅
【申请人】新疆畜牧科学院生物科技研究所