专利名称：Rosea 1和Delila作为筛选标记在菊花转基因育种中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种菊花可视标记基因Rosea I和Delila在菊花转基因育种中的应用。
背景技术：
菊花是我国的传统名花，具有重要的观赏价值和经济价值。目前转基因工程技术由于其巨大的优越性，正成为观赏植物育种的重要手段。但是在遗传转化过程中，使用的标记基因会产生潜在的生态环境和食品安全性问题，因此使用安全标记基因或去除选择标记已成为基因工程育种的重要目标和发展趋势。
标记基因的安全性问题是近年来国际上关注的热点，截止目前解决转基因植物安全性的主要策略有两种1、开发使用无争议的生物安全标记基因或对抗性基因标记进行一定修饰；2、在转化时仍使用传统的抗性标记基因，但获得转基因植株后再将其去除。目前，利用无争议的生物安全标记基因是提高标记基因的安全性最为有效的办法，是基因工程发展的必然趋势(王永飞，2004)。与常规标记基因相比，生物安全标记基因没有抗生素或除草剂抗性，相对来说对生物是安全的，目前有应用前景的安全标记基因可以分成两大类负向选择系统和正选择系统，主要包括化合物解毒酶基因、糖类代谢酶基因、激素代谢酶基因、报告基因等。去除转基因植物中标记基因的方法主要有共转化法、位点特异重组酶系统、转座子法、多元自主转化载体系统和同源重组等方法。花青素可视标记基因属于生物安全标记基因。花青素代谢调节基因导入植物细胞之后，细胞可能变成红色，无需进行组织化学测试而杀死植物组织，用一般的解剖镜甚至肉眼即可观测，在众多的植物遗传转化报告基因中是最方便的一种。目前，这些基因已被广泛应用到单子叶植物遗传转化条件的优化上。单立波等(2009)研究了玉米花色素苷合成调节基因Cl-R在小麦幼胚、玉米愈伤组织、水稻愈伤组织、烟草叶片中的瞬时表达情况。由于调节基因Cl-R激活了植物体细胞内花色素苷的合成，因此不需任何生色底物，即可活体观察到花素苷的表达。结果表明，对于小麦、水稻、玉米，枪击48小时后，放大2倍便可见红色斑点，且其表达强度远高于⑶S的表达，证明Cl-R基因可以作为一个很好的衡量打枪效果的指示，同时还证明其在双子叶植物烟草叶片的基因枪转化瞬时表达体系中也起同样的作用。目前对于植物花青素的时空合成机制已有深入的研究，不同植物中的花青素生物合成受两类基因的控制一类是结构基因，编码合成代谢中的酶类；另一类是调节基因，调节结构基因的表达强度和程式。在花青素合成途径中，调节基因影响着结构基因的表达方式和表达强度，每一步酶促反应均是调节基因作用的靶位点。目前植物中已分离和鉴定了 3类花青素合成的转录因子(Ramsay and Glover, 2005): (I) R2R3-MYB 蛋白；(2) MYC 家族的 bHLH 蛋白；(3)WD40蛋白。利用转座子标签等技术现已从金鱼草、玉米、矮牵牛、紫苏和拟南芥等多种植物中分离出相应的调节基因(刘仕芸等，2006):如属于MYB型的玉米cl/pl基因，矮牵牛an2、an4基因，金鱼草roseal/2、venosa基因；bHLH型的玉米r/b基因、ini基因，紫苏myc_rp/gp、mycf3gl基因，金鱼草Delila, mutabilis基因；WD40型的矮牵牛anil基因、紫苏pfwd基因、拟南芥ttgl等。研究表明，多数调节基因对花青素途径的调控是在结构基因转录水平上的调控，并且多数的调控是转录激活，只有少数几种调节基因为转录抑制调控。金鱼草中3个调控基因Deli la、eluta和rosea主要对花青素合成途径的后阶段起调节作用，而对早期CHS和CHI阶段表现微量调控(Martin et al.，1991)。
随着转基因工程中抗生素标记基因带来的问题，目前研究安全标记基因成为人们解决这一问题的主要方法。因此寻求安全标记基因成为转基因工程的热点和难点。花青素可视标记的应用为安全转基因提供了一种新的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供Rosea I和Delila作为筛选标记在菊花转基因育种中的应用。本发明提供的Rosea I和Delila作为筛选标记在菊花转基因育种中的应用，具体是将金鱼草的花青素调节基因Rosea I和Delila共转化到菊花中，与未转化的对照相比，出现花青素积累或花青素积累量增加的即可初步判断为转基因阳性植株。在一个实施方案中，Rosea I基因的启动子为拟南芥根部特异性启动子ATH-root,Delila基因的启动子为组成型35S启动子。茎部出现花青素积累或花青素积累量增加的即可初步判断为转基因阳性植株。其中，所述的菊花为地被菊‘地毯粉’。本发明还提供一种菊花转基因的方法。本发明提供的菊花转基因的方法，其为通过农杆菌介导的方法将金鱼草花青素调节基因Rosea I和Delila共转化到菊花中。其中，所述的Rosea I基因的启动子为拟南芥根部特异性启动子ATH-root，Delila基因的启动子为组成型35S启动子。其中，所述的菊花为地被菊‘地毯粉’。本发明通过将外源基因Rosea I和Delila整合进菊花基因组，转基因植物茎部在自然条件下出现明显紫红色，与对照有明显差异。而且表型观察与分子鉴定的符合率为75%，表明Rosea I和Delila可以作为菊花转基因工程中的安全标记基因，避免抗生素等标记基因对生态环境产生危害。
图I所示为质粒pJAM-root-Ros/DEL载体构建流程。图2 所示为质粒 pJAM-root-Ros/DEL 的 PCR 鉴定。图3所示为转基因植株的PCR鉴定。M，Marker DL15000 ；1为阴性对照水；2_3为阳性对照质粒；4为阴性对照植株；5-8为pJAM-root-Ros/Del转化阳性植株。图4所示为转基因植株的Southern检测。I为阴性对照水；2_3为阳性对照质粒；4为阴性对照质粒；5-8为pJAM-root-Ros/Del转化阳性植株。图5所示为对目的基因Delila的表达进行了 RT-PCR检测。M，Marker DL15000 ；I为阴性对照水；2为阳性对照质粒；3为阴性对照植株；4-5为pJAM-root-Ros/Del转化阳性植株。图6所示为转Roseal/Delila基因菊花茎段。A、B为对照植株；C、D为转化植株。图7所示为转Roseal/Delila基因菊花不同时期茎段图片。A、B为移栽植株；C、D为组培苗。
权利要求
1.Rosea I和Delila作为筛选标记在菊花转基因育种中的应用。
2.如权利要求I所述的应用，其特征在于，将金鱼草的花青素调节基因RoseaI和Delila共转化到菊花中，与未转化的对照相比，出现花青素积累或花青素积累量增加的即可初步判断为转基因阳性植株。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的RoseaI基因的启动子为拟南芥根部特异性启动子ATH-root，茎部出现花青素积累或花青素积累量增加的即可初步判断为转基因阳性植株。
4.如权利要求f3任一项所述的应用，其特征在于，所述的菊花为地被菊‘地毯粉’。
5.一种菊花转基因的方法，其特征在于，通过农杆菌介导的方法将金鱼草花青素调节基因Rosea I和Delila共转化到菊花中。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的RoseaI基因的启动子为拟南芥根部特异性启动子ATH-root。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述的菊花为地被菊‘地毯粉’。
全文摘要
本发明涉及金鱼草花青素调节基因Rosea 1和Delila在菊花转基因育种中的应用。Rosea 1和Delila基因转入菊花后可在菊花茎中产生可视标记，从而区别转基因与非转基因植株。在菊花转基因工程中可以用该基因代替抗生素标记基因，避免抗生素等标记基因对生态环境产生危害。
文档编号C12N15/29GK102719450SQ20121020191
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月15日 优先权日2011年6月17日
发明者张启翔, 张秀海, 王叶, 石少川, 程堂仁, 高亦珂 申请人:北京林业大学