专利名称：太平洋牡蛎est微卫星标记的筛选方法
技术领域：
本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济贝类太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)EST(Express Sequence Tag，表达序列标签)微卫星标记的筛选方法和应用。
背景技术：
太平洋牡蛎原产于日本、韩国、中国等地，是世界上养殖范围最广、产量最高的海洋贝类，也是我国重要的海水养殖种类之一。在我国，太平洋牡蛎养殖业主要分布于辽宁，山东，福建，广东等沿海地区。随着对太平洋牡蛎遗传多样性研究、遗传选育改良以及遗传图谱构建等研究工作的不断深入，对太平洋牡蛎分子标记的需求也越来越多。遗传改良或品种培育是太平洋牡蛎养殖稳定发展的动力，许多研究表明，遗传变异水平与生物的生长速度、抗病能力等生产性状密切相关，因此，开发太平洋牡蛎的分子遗传标记，检测太平洋牡蛎遗传多样性、研究其遗传结构，进而实施分子标记辅助选育，对于太平洋牡蛎的育种和养殖都具有十分重要的意义。
EST是指通过从cDNA文库中随机挑取的克隆，进行大规模测序所获得的cDNA的5’或3’端序列，长度一般为150-500bp。近年来大量快速增长的EST数据已成为SSR的重要来源，约有1-5％的EST含有SSR。与gSSR标记相比，从EST中获得SSR，建立EST-SSR标记更经济、更有特点；由于EST是功能基因的表达片段，在其中发现的微卫星标记会直接和功能基因相关，并有可能和一些生产性状相关联，这些特点对遗传图谱构建以及标记辅助选育都有很高的应用价值；同时，由于不同物种间基因共显性和保守性，从一种物种中开发的EST-SSR可能同时用于近缘的其他物种研究，从而为比较基因组学、同源基因克隆提供新的途径。因此，EST-SSR已被用于构建遗传图谱、分离与鉴定新基因、基因表达差异研究、比较基因组研究和制备DNA芯片等方面。利用EST微卫星标记，可能把太平洋牡蛎重要经济性状与之关联起来，达到分子标记辅助育种的目的，并可进一步进行太平洋牡蛎功能基因的研究。目前还未见关于太平洋牡蛎EST微卫星标记的研究报道。
发明的内容
本发明的目的是提供一种太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法和应用。
本发明目的是这样实现的首先利用GeneBank公布的太平洋牡蛎的ESTs的序列，利用微卫星检索软件SSRhunter进行微卫星位点的查找，对于2-6个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星片断进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到微卫星标记。
从太平洋牡蛎ESTs序列进行太平洋牡蛎微卫星分析的步骤是从NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库搜集并下载(以FASTA格式)已有的EST序列，利用SSRhunter软件逐一查找分析所得的序列，对2-6个碱基重复单元、重复次数大于5的微卫星DNA序列进行分离；采用软件DNAstar中的SeqMan对含有微卫星的ESTs进行聚类分析，选取聚类在不同contig中的ESTs设计引物。
对于太平洋牡蛎的ESTs设计引物，其设计引物参数为(1)引物长度为17-25bp；(2)GC含量要求大于40％；(3)退火温度大于40℃；(4)预期的PCR产物长度为100-300bp。
对于太平洋牡蛎利用微卫星标记进行PCR扩增，其加样参数为总体积20μl，其中含有正反向引物0.2μM、0.2mMdNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、1×PCR buffer、1.5-2.5mM的Mg2+、Taq酶，模板量分别是50-100ng。
对于PCR产物的检测扩增得到的产物用8-10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，电压是1-8V/cm，电泳完毕之后用EB(溴化乙锭终，浓度0.5-0.6μg/m1)染色20-30分钟，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析确定多态性。
在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件Primer Premier 5.0和DNAstar中的Primerselect设计引物Tm值在45-65℃之间；扩增反应分别用MJ-100和BioRad-200 PCR仪，PCR程序为94℃变性2分钟之后进入循环，94℃变性30或者40秒，根据不同的退火温度退火30秒，72℃延伸30秒到1分钟不等，反应进行30-35个循环。
本发明的应用用于做太平洋牡蛎种质资源和遗传多样性的分析，分子群体遗传学、种质资源鉴定、遗传图谱的构建和功能基因的研究，进一步用于太平洋牡蛎的育种和养殖。
图1Cg-e001 EST-SSR标记在群体中的扩增结果图2Cg-e018 EST-SSR标记在群体中的扩增结果
具体实施例方式
实施例一微卫星位点的筛选及其多态标记的确定。实验中所用的太平洋牡蛎均来自福建养殖群体。
1、微卫星位点的来源和微卫星序列的筛选从NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库搜集并下载(以FASTA格式)已有的EST序列，利用SSRhunter软件逐一查找分析所得的3390个序列，对2-6个碱基重复单元、重复次数大于5的微卫星DNA序列进行分离。采用软件DNAstar中的SeqMan对含有微卫星的ESTs进行聚类分析，选取聚类在不同contig中的ESTs设计引物。
2、微卫星标记引物的设计在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件Primer Premier 5.0和DNAstar中的Primerselect设计引物；引物要求满足以下条件(1)引物长度为17-25bp；(2)GC含量要求大于40％；(3)退火温度大于40℃；(4)预期的PCR产物长度为100-300bp。
3、引物的优化不同的引物根据不同的Tm值进行优化(Tm值上下10度左右)。扩增反应分别用MJ-100和BioRad-200 PCR仪，PCR程序为94℃变性2分钟之后进入循环，94℃变性30或者40秒，根据不同的退火温度退火30秒，72℃延伸30秒到1分钟不等，反应进行35个循环。反应体系为20μl其中含有正反向引物0.2μM、0.2mMdNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、1×PCR buffer、1.5-2.5 mM的Mg2+、Taq酶，模板量分别是50-100ng。模板是随机的5个太平洋牡蛎样本。扩增得到的产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选取无或杂带少、特异性产物较高的PCR对应的温度作为最佳的退火温度，对应的Mg2+作为最佳Mg2+的浓度。
10×PCR buffer含有100mM Tris-HCL(三羟基甲基氨基甲烷-盐酸pH9.0)，500mM KCL(氯化钾pH9.0)，1％Triton X-100(曲拉通X-100)4、微卫星位点的确定根据上面筛选出来的Tm值和Mg2+选取20个个体检测这些微卫星标记的多态性。PCR的反应程序是94℃变性10分钟之后进入循环，94℃变性30或者40秒，根据不同的退火温度退火30秒，72℃延伸30秒到1分钟不等，反应进行35个循环。反应体系为20μl其中含有正反向引物0.2-1μM、0.2mM、1×PCR buffer、1.2-2.0mM的Mg2+、Taq酶，模板量分别是50-100ng。PCR扩增产物用8％的聚丙烯酰胺电泳，电压是1-8V/cm，电泳完毕之后用EB(溴化乙锭终，浓度0.5μg/ml)染色30分钟，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析确定多态性，最后筛选出9个位点作为太平洋牡蛎微卫星标记，这些标记的具体信息如表一。
表一.开发获得的9个太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的EST-SSR标记
实施例二应用实例1、提取太平洋牡蛎的DNA本实验所取的太平洋牡蛎材料是随机提取13个DNA样品，从冷冻的肌肉组织中提取DNA。剪取100mg肌肉组织，剪碎后置于0.7ml的抽提缓冲液(6M Urea(尿素)，10mMTris-HCI.125mM NaCI(氯化钠)，1％SDS(十二烷基肌硫酸钠)，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，pH＝7.5)中，加入终浓度为0.1mg/ml的蛋白酶K(20mg/ml)，37℃消化一夜。用苯酚∶氯仿(1∶1)抽提反应物三次，提取上清液用等体积的氯仿抽提一次。取上清液用异丙醇进行沉淀，然后溶解于5001μl×TE(10mM Tris.HCI，1mM EDTA，pH＝8.0)中。用RNase(20μg/ml)37℃处理DNA样品1小时，然后用苯酚/氯仿提取液进行DNA纯化用苯酚/氯仿抽提一次、氯仿抽提一次。然后提取上清液加入两倍体积的无水乙醇和十分之一倍体积的3M NaAc(醋酸钠)，摇匀之后12000rpm离心收集DNA，再用70％乙醇洗涤两次，待乙醇完全蒸发之后，加入50μl1×TE于-20℃保存待用。
2、PCR扩增PCR的反应条件是50ng太平洋牡蛎基因组DNA，引物1μM、0.2mMdNTP、1×PCRbuffer、1.5mM的Mg2+、Taq酶。PCR的反应程序是94℃变性10分钟之后进入循环，94℃变性30，Tm退火30秒，72℃延伸1分钟，反应进行35个循环。4℃保存PCR产物。
3、电泳检测PCR扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压是8V/cm，电泳完毕之后用EB(终浓度是0.5μg/ml)染色30分钟，在凝胶成像系统下观察记录成像结果如图1、图2所示。
权利要求
1.一种太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，其特征是首先利用GeneBank公布的太平洋牡蛎的ESTs的序列，利用微卫星检索软件SSRhunter进行微卫星位点的查找，对于2-6个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星片断进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到微卫星标记。
2.根据权利要求1中所述的太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，其特征是从太平洋牡蛎ESTs序列进行太平洋牡蛎微卫星分析，步骤是从NCBI数据库搜集并下载以FASTA格式已有的EST序列，利用SSRhunter软件逐一查找分析所得的序列，对2-6个碱基重复单元、重复次数大于5的微卫星DNA序列进行分离；采用软件DNAstar中的SeqMan对含有微卫星的ESTs进行聚类分析，选取聚类在不同contig中的ESTs设计引物。
3.根据权利要求1中所述的太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，其特征是对于太平洋牡蛎的ESTs设计引物，其设计引物参数为(1)引物长度为17-25bp；(2)GC含量要求大于40％；(3)退火温度大于40℃；(4)预期的PCR产物长度为100-300bp。
4.根据权利要求1中所述的太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，其特征是对于太平洋牡蛎利用微卫星标记进行PCR扩增，其加样参数为总体积20μl，其中含有正反向引物0.2μM、0.2mMdNTP、1×PCR buffer、1.5-2.5mM的Mg2+、Taq酶，模板量分别是50-100ng。
5.根据权利要求1中所述的太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，其特征是对于PCR产物的检测扩增得到的产物用8-10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，电压是1-8V/cm，电泳完毕之后用浓度0.5-0.6μg/ml的EB染色20-30分钟，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析确定多态性。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，其特征是在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件Primer Premier 5.0和DNAstar中的Primerselect设计引物Tm值在45-65℃之间；扩增反应分别用MJ-100和BioRad-200 PCR仪，PCR程序为94℃变性2分钟之后进入循环，94℃变性30-40秒，根据不同的退火温度退火30秒，72℃延伸30秒到1分钟不等，反应进行30-35个循环。
7.根据权利要求1中所述的太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，其特征在于所筛选到的微卫星标记的特异引物分别为Cg-e001FTTAACAAGAAAGAAAACGAAGAAA，RTGTATGGACGCCCGCAGAA；Cg-e002FTCGACACAGGATGGATGC，RATGGATTTAAGACTTCTGACACTG；Cg-e003FGTGAATGTACAAAGAATGGT，RGTAAACAAAACAATCAAGTAAAAA；Cg-e004FGGACCCCCACCTTACTATGC，RGTGTCCGAACCCGAAACCA；Cg-e006FTCTAACAAAACCCCGACTG，RCGTGATGGCAAAAAGAAG；Cg-e018FAACAACAACATGGAAACACCT，RTCAACAAAGAAACACATCCTG；Cg-e019FGAGGGCAAGATCAAAGTAGAAA，RATGCCCAATCACAAGACA；Cg-e020FGATTCAGCATTTCAAAGATACCC，RACCTCCTGTTCCCCCTGTT；Cg-e022FCCTTCCTCTCATCATCATCATCAC，RAAGAGGGAAGAGGAGGAGAAGA。
全文摘要
本发明公开一种太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，包括利用GeneBank公布的太平洋牡蛎的ESTs的序列，利用微卫星检索软件SSRhunter进行微卫星位点的查找，对于2－6个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星片断进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到微卫星标记；本发明用于做太平洋牡蛎种质资源和遗传多样性的分析，分子群体遗传学、种质资源鉴定、遗传图谱的构建和功能基因的研究，进一步用于太平洋牡蛎的育种和养殖。
文档编号C12N15/11GK101058831SQ200710027648
公开日2007年10月24日 申请日期2007年4月23日 优先权日2007年4月23日
发明者喻子牛, 王艳红 申请人:中国科学院南海海洋研究所