用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于贝类遗传育种的分子标记技术领域，具体设及一种用于合浦珠母贝微 卫星家系鉴定的微卫星标记引物及鉴定方法和应用。
【背景技术】
[0002] 合浦珠母贝（Pinctada fucata)亦称"马氏珠母贝"，双壳纲，珍珠贝科，附着生活 在水质澄清有珊瑚礁或多沙碱的浅海底，分布于南海，日本亦产，除产珍珠外，肉可食，壳可 制纽扣，是中国及世界上海水珍珠培育的主要种类之一，我国华南沿海合浦珠母贝所产珍 珠即为举世闻名的"南珠"。
[0003] 由于在长期的养殖过程中不注重选育种，并且养殖模式陈旧，养殖场地老化，育珠 技术落后，致使养殖合浦珠母贝生长缓慢，珍珠质分泌能力下降，育珠能力降低，导致人工 养殖珍珠质量和产量都明显下降，珠粒小，珠层薄，色泽差，珍珠养殖效益低下，许多养殖户 放弃养殖珍珠而改养其它品种，严重限制了 "南珠"养殖产业的发展。因此，尽快开展合浦珠 母贝良种选育工作是促进其养殖业稳定、健康发展的必要手段。
[0004] 在贝类遗传育种研究中，清晰的系谱信息对于家系的选育和亲本的管理至关重 要，同时也是明确个体间亲缘关系，建立正确系谱的重要手段。通过亲缘关系鉴定，开展家 系分析研究可W阐明繁殖成功率，增殖放流幼体扩散等许多有关遗传学方面和繁殖生态学 的科学问题。在合浦珠母贝育种过程中，亲本的数量都不会很多，加之逐代人工繁殖，导致 了很多苗种出现了衰退现象。
[0005] 因此有效的系谱鉴定可W 了解育种亲本的育种价值，同时对提高育种效率和生产 实践都有重要意义。W微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用 最广泛最可靠的手段之一。已应用到扇贝、太平洋牡颇、耳鲍、凡纳滨对邮、中国对邮、牙解 等水产经济动物育种中。
[0006] 目前，关于将微卫星标记应用于合浦珠母贝家系鉴定研究的报道甚少。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定 的微卫星标记引物。
[000引本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种利用上述微卫星标记引物进行合 浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法，该方法易于同时分型检测，可W用于合浦珠母贝的群体 遗传结构，遗传育种学评估及亲子鉴定等，同时可大幅度节约实验成本。
[0009] 本发明所要解决的最后一个技术问题是提供一种利用上述用于合浦珠母贝微卫 星家系鉴定的微卫星标记引物在合浦珠母贝家系鉴定中的应用。
[0010] 本发明所要解决的第一个技术问题是通过W下技术方案来实现的：一种用于合浦 珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物，所述微卫星标记引物共有9个引物对，分别为 PF-3、PF-4、PF-II、PF-13、PF-16、PF-27、PF-30、PF-44 和 PF-48，其中：
[0011] 引物对PF-3的核巧酸序列如沈Q ID NO: I和沈Q ID N0:2中所示；
[001^ 弓|物对PF-4的核巧酸序列如沈Q ID N0:3和沈Q ID N0:4中所示；
[OOU]引物对PF-Il的核巧酸序列如沈Q ID N0:5和沈Q ID N0:6中所示；
[0014] 引物对PF-13的核巧酸序列如沈Q ID N0:7和沈Q ID N0:8中所示；
[001引引物对PF-16的核巧酸序列如沈Q ID N0:9和沈Q ID NO: 10中所示；
[0016] 引物对PF-27的核巧酸序列如沈Q ID NO: 11和沈Q ID NO: 12中所示；
[0017] 引物对PF-30的核巧酸序列如沈Q ID NO: 13和沈Q ID NO: 14中所示；
[001引引物对PF-44的核巧酸序列如沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16中所示；
[0019] 引物对PF-48的核巧酸序列如沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18中所示。
[0020] 本发明所要解决的第二个技术问题是通过W下技术方案来实现的：上述合浦珠母 贝微卫星家系的鉴定方法，包括W下步骤：
[0021] (1)合浦珠母贝亲本及子代DNA提取:选取合浦珠母贝作为亲本进行全同胞家系繁 殖，繁殖后选取亲本及子代肌肉组织，采用Magen动物DNA提取试剂盒提取，获得合浦珠母贝 亲本及子代的DNA作为模板待用；
[0022] (2)微卫星标记引物巧光修饰:选取权利要求1中的9个引物对，分成3组，其中PF- 4、PF-11 和 PF-30 为一组，PF-13、PF-27 和 PF-44 为一组，PF-3、PF-16 和 PF-48 为一组，在每组 引物的正向引物5'端分别用FAM、肥X和ROXS种不同的巧光基团进行修饰，用于PCR分析；
[0023] (3)巧光PCR:采用巧光PCR反应利用步骤(2)中巧光基团修饰过的9个引物对分别 对步骤(1)中的亲本及子代的DNA进行PCR扩增，扩增产物按照步骤(2)中分组的方法进行混 合，混合物作为上机待测样品；
[0024] (4)合浦珠母贝微卫星家系鉴定:将上机待测样品采用基因分析仪进行分析，读取 每个样品的基因型，对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，获得合 浦珠母贝的微卫星家系。
[0025] 在上述合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法中：
[00%] 步骤(3)中巧光PCR反应时，2化L反应体系优选包括15.2化双蒸水，2化10 X PCR缓 冲液，浓度为10皿/L的正、反引物各0.化L，浓度为lOmm/L的dNTP 0.化L，浓度为抓/化的化q 酶0.化L，化L DNA模板。
[0027] 步骤(3)中巧光PCR反应时，优选95 °C预变性5min，95 °C变性30s，56 °C退火30s，72 。(:延伸30s，反应进行30个循环，最后72°C再延伸lOmin。
[0028] 步骤(4)中优选采用软件(ERVUS3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判 定子代个体的父母本。
[0029] 采用软件CERVUS3.0可计算亲本和子代在各微卫星座位上等位基因频率、杂合度、 期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、化rdy-Weinberg平衡及无效等位基因频率等信 息，从而判定子代个体的父母本。
[0030] 进一步的，本发明提供的一种合浦珠母贝微卫星家系的鉴定方法，包括W下步骤：
[0031] (1)合浦珠母贝DNA提取
[0032] 选取健康发育良好的合浦珠母贝作为亲本进行全同胞家系繁殖，剪取亲本及子代 闭壳肌组织样品放于无水乙醇中，采用Magen软体动物DNA提取试剂盒来操作，检测质量和 浓度后，稀释至IO化g AiL，存放于-20°c保存备用；
[0033] (2)多态性微卫星标记引物的筛选和引物合成
[0034] 选取9对微卫星引物，按照片段大小分成3组，其中，引物PF-4,PF-11，PF-30，为一 组，引物PF-13，PF-27，PF-44，为一组，引物PF-3，PF-16，PF-48，为一组;在正向引物5 '端分 另Ij用FAM，肥X，ROX^种不同的巧光基团进行修饰，用于PCR分析；
[0035] (3)巧光 PCR
[0036] 采用巧光PCR反应对亲本和子代DNA样品进行PCR扩增，扩增产物按照步骤(2)中所 选微卫星引物分组的方法进行混合，作为上机检测的样品；
[0037] (3)微卫星位点基因分型W及斑节合浦珠母贝微卫星家系鉴定
[0038] 样品在ABI3730)(L基因分析仪上进行分型，用GS-500作为内参，用GeneMa邮er V 3.2软件读取每个样品的基因型，采用CERVUS 3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分 析，判定子代个体的父母本。
[0039] 本发明所要解决的第=个技术问题是通过W下技术方案来实现的：上述用于合浦 珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物在合浦珠母贝家系鉴定中的应用。
[0040] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0041] (1)采用本发明中的引物，首次在合浦珠母贝上利用巧光标记的多态微卫星标记 建立了亲子鉴定平台，其鉴定准确率达到了90.24%;
[0042] (2)本发明方法能快速、有效地鉴别合浦珠母贝不同家系及来源，为合浦珠母贝的 选育，繁殖配组和增殖放流评估提供了依据；
[0043] (3)本发明按照微卫星引物扩增片段大小和巧光标记的颜色不同进行组合，将3个 微卫星引物分另化CR扩增之后的DNA产物混合在一起上样检测，比普通PCR检测方法提高了 3 倍效率，同时节约了成本和时间；
[0044] (4)本发明选择的微卫星位点等位基因数目较多，多态性高，可W用于合浦珠母贝 的群体遗传结构，遗传育种学评估及亲子鉴定等，同时可大幅度节约实验成本。
【具体实施方式】
[0045] W下结合具体实施方法对本发明进行详细说明。
[0046] 实施例1用于合浦珠母贝微卫星家系鉴定的微卫星标记引物的筛选与合成
[0047] 通过转录组测序筛选到含有合浦珠母贝微卫星重复序列的unigene，然后从合浦 珠母贝转录组文库将其中检测到含有微卫星位点的序列设计微卫星特异性引物，检测其多 态性，经过筛选之后最终选择了9对条带清晰，多态性高的引物作为家系鉴定的引物，引物 在上海生工生物工程股份有限公司合成。
[004引本发明中选择的