一种新型特异结合lps的贝类模式识别受体lrrp的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型特异结合LPS的贝类模式识别受体LRRP。贝类模式识别受体LRRP，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本发明首次从太平洋牡蛎中分离出富含亮氨酸重复蛋白（Leucine-rich?repeat?protein,LRRP），可以特异的识别LPS，从而激发后续的免疫反应的新型贝类模式识别受体LRRP。本发明中的LRRP在贝类免疫识别中发挥中重要的作用，监控体内的革兰氏阴性菌的侵入状况，为贝类的抗病育种提供了重要的理论与实践依据。
【专利说明】—种新型特异结合LPS的贝类模式识别受体LRRP
【技术领域】:
[0001]本发明属于贝类免疫识别和免疫防御的分子机理领域，具体涉及一种新型特异结合LPS的贝类模式识别受体LRRP。
【背景技术】:[0002]贝类在我国沿海经济社会发展中占据举足轻重的地位，是世界上最重要经济类群之一，并具有巨大的发展潜力。太平洋牡贩(Crassostrea gigas),是软体动物门,双壳纲，珍珠贝目，牡蛎科动物，是一种重要的海洋生物资源，为全球性分布种类。然而，良种匮乏导致牡蛎免疫能力低下，疾病爆发，甚至出现大规模死亡，是制约产业发展的主要瓶颈。
[0003]在贝类免疫反应中，病原微生物的保守结构比如脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)等，可以作为模式识别分子(pattern-recognition molecule, PRM)被宿主所识别，继而激发宿主的免疫防御反应。
【发明内容】
:
[0004]本发明的目的是提供一种新型贝类模式识别受体LRRP。
[0005]本发明的新型贝类模式识别受体LRRP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0006]本发明还提供了一种编码上述新型贝类模式识别受体LRRP的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]—种含有新型贝类模式识别受体LRRP的基因的原核表达载体。
[0008]所述的原核表达载体可以为表达载体pGEX-4T-l。
[0009]一种含有含有新型贝类模式识别受体LRRP的基因的原核表达载体的细菌。
[0010]所述的细菌可以为大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0011]本发明还提供了新型贝类模式识别受体LRRP在制备特异识别脂多糖的药物中的应用。
[0012]本发明首次从太平洋牡贩中分离出富含亮氨酸重复蛋白(Leucine-rich repeatprotein, LRRP)，可以特异的识别LPS，从而激发后续的免疫反应的新型贝类模式识别受体LRRP。本发明中的LRRP在贝类免疫识别中发挥中重要的作用，监控体内的革兰氏阴性菌的侵入状况，为贝类的抗病育种提供了重要的理论与实践依据。
【专利附图】
【附图说明】:
[0013]图1.表达和纯化的贝类模式识别受体LRRP重组蛋白
[0014]M:蛋白Marker ；Lane 1:重组表达蛋白GST-LRRP (贝类模式识别受体LRRP重组蛋白)；Lane2:纯化后的GST-LRRP (贝类模式识别受体LRRP重组蛋白)，箭头指示重组表达的目的蛋白GST-LRRP ；
[0015]图2.ELISA分析重组蛋白对多种PRMs的结合能力，表明贝类模式识别受体LRRP可以特异的识别LPS。
[0016]注:0D,光密度值；LPS,脂多糖；PGN,肽聚糖；Glucan,葡聚糖；LTA,脂磷壁酸；Laminarin,昆布多糖。
【具体实施方式】
[0017]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0018]实施例1:
[0019]1、RNA 提取
[0020]总RNA的提取使用Trizol (Invitorgen)提取，具体步骤如下:(I)取50mg太平洋牡蛎组织于液氮预冷的研钵中，将组织磨成粉末之后，转移到装有Iml Trizol的离心管中，吹打、混匀;(2)加入200 μ L氯仿，剧烈震荡40s,室温放置5min ; (3)4°C，12，000 X g离心lOmin，吸取上清转移至新管；(4)加入0.5ml的异丙醇，混匀，_80°C沉淀过夜；(5) 4°C，12，OOO Xg离心10min，弃上清;(6)75%乙醇wash两次沉淀；(7)弃上清，加入100 μ L DEPC水溶解RNA。
[0021 ] 2.cDNA文库构建和cDNA全长的获得
[0022]I)全长 cDNA 文库构建使用 SMART cDNA library construction Kit(Clontech),具体步骤如下:(I)利用步骤I的RNA，使用MMLV合成cDNA第一条链；(2)使用LD PCR扩增cDNA ;(3)蛋白酶K消化并纯化cDNA产物；(4)Sfil消化，使用Chroma Spin400进行产物大小分离；(5)连接cDNA至XTripEx2载体，经λ噬菌体包装后，转化至宿主细胞中；
(6)检测cDNA文库滴度。
[0023]2 )从牡蛎转录组获得LRRP的EST序列；(3 )根据EST序列，设计用于RACE扩增的引物(First PCR引物:
[0024]LRRPFl: 5，-AGTAAATGTGCCGTGTGTGGGGAGT-3 ’ ;
[0025]LRRPRl: 5，-GA CCTCCTCTTCTTGTACTGAATGGAC-3，;
[0026]Nest PCR 引物:
[0027]LRRPF2:5，-TGCGGGCTTTACTCTGTTCTTATCG-3 ’ ;
[0028]LRRPR2:5 ’ -GTAATGCACAGATTTCCACGGGTAG-3 ’)，并进行 3 ’ RACE 和 5 ’ RACE 反应；
(4)再克隆至pGEM-T Easy载体(promega)，进行测序；(5)拼接RACE和EST序列，获取全长cDNA序列，该全长cDNA序列含有一个开放阅读框，该开放阅读框的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，含有1059个碱基，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，含有352个氨基酸，命名为贝类模式识别受体LRRP的基因。
[0029]3.原核表达载体构建
[0030](I)设计一对涵盖贝类模式识别受体LRRP ORF的引物(LRRPF3:5 ’ -CGGGATCC ATGGCGGACACTATGCTTGTTCG-3 ’ ; LRRPR3:5 ’ -GCCTCGAGTCAGTCACGATGCGGC CGCTCGA-3，)，引物的两端分别加入BamH-1和Xho-1位点和保护碱基；(2)使用这对引物进行PCR扩增(总PCR反应体系为 50μ 1，其中包括!12038.5μ L, IOXbuffer (含 Mg2+) 5 μ L，dNTP (10mM/L) I μ L,上下游引物(10μΜ)各2yL，模板cDNAlyL，ExTaq酶0.5 μ L ;反应条件为:94°C 2min，(94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 60sec) 35 个循环，72°C IOmin) ; (3) PCR 产物和 pGEX_4T_l载体分别使用BamH-1和Xho-1进行双酶切，并回收纯化酶切产物；(4)连接酶切后的PCR片段和pGEX-4T-l载体；(5)将连接产物转化至大肠杆菌DH5 α中，挑取阳性克隆，测序验证载体正确无误，测序结果表明，如SEQ ID N0.1所示的序列(贝类模式识别受体LRRP的基因)插入了 PGEX-4T-1载体中，进行后续试验，由此得到含有贝类模式识别受体LRRP的基因的 pGEX-4T-l 载体。
[0031]4.重组蛋白的原核表达和纯化
[0032](1)提取步骤3的大肠杆菌DH5CI中的含有贝类模式识别受体LRRP的基因的PGEX-4T-1载体，转化至大肠杆菌BL21 (DE3) ；(2)挑选单克隆并培养至OD=0.6，加入IPTG至终浓度为0.1mM, 22°C,180rmp的条件下诱导表达；(3) 4h后收集菌液，4°C，12，OOOXg离心10min ； (4)加入Lysozyme至终浓度2mg/ml,然后超声破碎；(5)使用GlutathioneSepharose4B (GE Healthcare)纯化重组蛋白，在12%SDS_PAGE胶分析纯化产物，其蛋白电泳图如图1所示，图1是表达和纯化的贝类模式识别受体LRRP重组蛋白，M:蛋白Marker ；Lanel:重组表达蛋白GST-LRRP (贝类模式识别受体LRRP) ；Lane2:纯化后的GST-LRRP ;箭头指示重组表达的目的蛋白GST-LRRP。由此得到纯化的贝类模式识别受体GST-LRRP重组蛋白。
[0033]5.ELISA
[0034](1)将 LPS、PGN> LTA> GLucan> Laminarin 等多种 PRMs 分别溶解在双蒸水(40mg/ml)中；(2)分别吸取50 μ I至96-孔板(Costar),室温放置，直至蒸干；(3) 60°C,半小时，固定 PRMs ；(4)加入 200 μ I 含有 BSA 的 Tris Buffer, 37 °C,2h ；(4)弃上清，TrisBuffer wash4次，每次2min ；(5)加入含有纯化好的贝类模式识别受体GST-LRRP重组蛋白，室温孵育 3h ; (6)弃上清，Tris Buffer wash4 次,每次 2min ; (7)加入 mouse ant1-GSTantibody (Abmat, 1:5000)，孵育 2h ； (8)弃上清，Tris Buffer wash4 次，每次 2min ； (9)加入 HRP 偶联的 goat ant1-mouse IgG (Abmat, 1:3000),孵育 2h ; (10)加入 HRP 底物TMB (Tiangen)进行显色，450nm光吸收测量结果。结果如图2所示，图2是ELISA分析贝类模式识别受体GST-LRRP重组蛋白对多种PRMs的结合能力，结果表明贝类模式识别受体LRRP可以特异的识别LPS。注:0D，光密度值；LPS，脂多糖；PGN，肽聚糖；Glucan，葡聚糖；LTA，月旨磷壁酸；Laminarin,昆布多糖。
【权利要求】
1.一种新型贝类模式识别受体LRRP，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的新型贝类模式识别受体LRRP的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.一种含有权利要求2所述的新型贝类模式识别受体LRRP的基因的原核表达载体。
4.根据权利要求3所述的原核表达载体，其特征在于，所述的原核表达载体为表达载体 PGEX-4T-1。
5.一种含有权利要求3所述原核表达载体的细菌。
6.根据权利要求5所述的细菌，其特征在于，所述的细菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
7.权利要求1所述的新型贝类模式识别受体LRRP在制备特异识别脂多糖的药物中的应 用。
【文档编号】C12N15/70GK103864910SQ201410075253
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月3日 优先权日:2014年3月3日
【发明者】张扬, 张跃环, 李军, 喻子牛 申请人:中国科学院南海海洋研究所