化合物i和化合物ii及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤癌症疾病预防和治疗的技术领域，更具体地说，涉及化合物I和 化合物II及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 恶性黑色素瘤是来源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤，是皮肤癌中常见的恶性肿 瘤，转移性强，目前主要的治疗方法是放疗、化疗和手术治疗，然而，传统的治疗并不能将 其彻底治愈，随着肿瘤免疫学、分子生物学的发展，对肿瘤进行免疫治疗已成为人们研究 的热点。Toll样受体（Toll like receptors, TLRs)是一类重要的模式识别受体，属于I 型跨膜蛋白，在各种免疫细胞上有表达，TLRs在激发先天性免疫和适应性免疫反应过程中 发挥重要作用。TLRs的激动剂作用于抗原递呈细胞，比如树突状细胞（Dendritic Cell， DC)，促进细胞因子的产生，从而更好的激发免疫反应。TLR7 (Toll like receptor 7)是 Toll样受体之一，TLR7的配体主要是病毒核酸成分，也可以识别一些合成的小分子激动 剂，TLR7被激活后能够引发较强的免疫反应。T7(第一反应物）是深圳大学深圳合成生 物学工程实验室合成的一种化学小分子TLR7受体的激动剂，据研究表明Τ7具有提高先 天性免疫的能力，在体外作用于骨髓来源的树突状细胞能够迅速产生炎症介质TNF-α和 IL-12以及作用于淋巴细胞迅速产生IFN-γ和IL-12,其中T7的来源和制备过程参考文 献"Local administration of a novel Toll-like receptor 7agonist in combination with doxorubicin induces durable tumouricidal effects in a murine model of T cell lymphoma" Journal of Hematology&Oncology. 2015, Mar 4 ；8(1) :21. doi:10. 1186/ S13045-015-0121-9)"。利尿酸（Ethacrynic acid，EA，第二反应物）又叫依他尼酸，是一种 利尿剂，有文献表明，利尿酸具有多种抗肿瘤效应，但无法激发特异性的抗肿瘤细胞免疫反 应，使得其抗肿瘤效应差、副作用大，肿瘤细胞反复复发生长。
[0003] 乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，患者大部分是女性，并且晚期患者 易发生转移。目前，乳腺癌的治疗方式主要是手术治疗、放疗、化疗，然而放疗和化疗在杀伤 癌细胞同时也会杀伤正常细胞，严重破坏了机体的免疫系统。肿瘤生物治疗是肿瘤治疗的 第四种方式，肿瘤免疫治疗是肿瘤生物治疗中比较有应用前景的一种治疗方法，而这种治 疗对乳腺癌也是比较好的一种治疗方法。肿瘤免疫治疗的目的是激发或调动机体的免疫系 统，增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力，诱导机体产生有效识别肿瘤相关抗原的免疫细胞，从 而控制和杀伤肿瘤细胞。R0R1 (Receptor-tyrosine-kinase-like orphan receptor，第三 反应物）是一个典型的I型孤儿受体酪氨酸激酶样表面蛋白，研究发现许多人源癌细胞系 表达R0R1，R0R1在乳腺腺癌中高表达，但是正常乳腺组织不表达R0R1，R0R1的表达与肿瘤 生长有关，R0R1表达越高，肿瘤生长越快。据文献报道，R0R1的表达与乳腺腺癌早期转移、 复发及预后密切相关，R0R1表达越高转移、复发的概率越高并且预后越差，高表达R0R1的 患者无转移生存期比低表达患者短，阻碍R0R1的表达能有效抑制癌细胞向肺部转移，因此 R0R1可以作为肿瘤治疗的靶点，但是R0R1的免疫原性较弱，不能激发先天性免疫。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供结构式为式I和式II的化合物及其制备方法和应用，即化 合物I和化合物II及其制备方法和应用，具体是提供由T7 (第一反应物）和EA (第二反应 物）偶联得到的结构全新的式I的化合物，并由式I的化合物联合R0R1 (第三反应物）共 价得到全新的式II的化合物，解决了现有技术中的EA和R0R1无法诱导免疫反应而引起的 治疗效果差及带来的不良反应等问题。
[0005] 本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种式I的化合物，具有如下结构式：
[0007] 上述式I化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0008] S1、将第一反应物
和第二反应物利尿酸
溶于反应溶剂中，加入HBTU苯并三氮唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸盐、三乙胺和催化 剂4-二甲氨基吡啶，室温下搅拌反应；
[0009] S2、反应完成后将反应液倒入水中，抽滤，滤渣经水洗、干燥得到式I的化合物。
[0010] 在本发明的式I的化合物的制备方法中，在步骤S1中，所述第一反应物、第二反 应物、苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸盐和三乙胺以下述摩尔比份数进行反 应：第一反应物4-12份、第二反应物5-15份、HBTU苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六 氟磷酸盐5-15份以及三乙胺18-30份。优选地，所述第一反应物、第二反应物、苯并三氮 唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸盐和三乙胺以下述摩尔比份数进行反应：第一反应物 6-10份、第二反应物7-12份、苯并三氮唑-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸盐7-12份以及 三乙胺22-28份；更优选地，第一反应物和第二反应物之间的反应摩尔比为1 :1。而催化剂 4_二甲氨基吡啶的用量为催化量即可。
[0011] 在本发明的式I的化合物的制备方法中，在步骤S1中，所述反应溶剂选自四氢呋 喃、甲苯、苯、Ν，Ν-二甲基甲酰胺、Ν，Ν-二甲基乙酰胺和Ν-甲基吡咯烷酮中的任意一种或多 种，优选Ν，Ν-二甲基甲酰胺。
[0012] 在本发明的式I的化合物的制备方法中，步骤S1的反应时间为8-24小时，优选为 10-15小时。
[0013] 在本发明的式I的化合物的制备方法中，在步骤S2后还包括步骤S3 :将得到的式 I的化合物经柱层析分离进行纯化，其中柱层析分离所用溶剂为二氯甲烷和甲醇的混合溶 剂，二氯甲烷与甲醇的体积比为20 :1。
[0014] 上述式I的化合物具有在制备用于预防和免疫治疗黑色素瘤引起的皮肤癌的药 物中的用途。
[0015] 本发明还提供了由式I的化合物制备得到的式II的化合物，具有如下结构式：
[0017] 上述式II的化合物的制备方法是：将第三反应物溶于二甲基亚砜中，加入式I的 化合物，室温搅拌8-24小时，优选搅拌12小时，利用液相色谱-质谱联用监测反应，制备液 相色谱分离，得到式II的化合物；
[0018] 其中，第三反应物为R0R1，其结构式如下：
[0020] 第三反应物与式I的化合物的反应摩尔配比为1 :1。
[0021] 上述式II的化合物具有在制备用于预防和免疫治疗乳腺癌的药物中的用途。
[0022] 实施本发明的式I和式II的化合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：本 发明中的新合成的式I的化合物在大大提高利尿酸（EA)的抗肿瘤效果上，能够激发抗肿瘤 的先天性免疫和细胞免疫，探索了抗肿瘤免疫协同一体化的药物设计；证明了式I的化合 物抗黑色素瘤的免疫反应机制。本发明由式I的化合物与R0R1共价制备的式II的化合物 明显减慢了乳腺癌皮下移植瘤的生长，证明式II的化合物治疗乳腺癌的免疫反应机制，同 时证明了式I的化合物不仅具有激发先天性免疫和适应性免疫的功能，还具有有免疫佐剂 的作用。
【附图说明】
[0023] 图1为式I化合物T7-EA的HPLC谱图；
[0024] 图2为式I化合物T7-EA的质谱图；
[0025] 图3A为不同浓度的式I化合物T7-EA体外诱导脾淋巴细胞产生IFN- γ影响的对 比图；
[0026] 图3Β为不同浓度的式I化合物Τ7-ΕΑ体外诱导脾淋巴细胞产生IL-12影响的对 比图；
[0027] 图4为不同浓度的式I化合物T7-EA对细胞毒性T淋巴细胞增殖影响的对比图；
[0028] 图5为式I化合物Τ7-ΕΑ、Τ7、ΕΑ和对照组分别对肿瘤增长影响的对比图；
[0029] 图6为式I化合物Τ7_ΕΑ、Τ7、ΕΑ和对照组分别引起细胞毒性Τ淋巴细胞引起反应 的对比图；
[0030] 图7为式II化合物的质谱图；
[0031] 图8Α为不同浓度的Τ7-ΕΑ诱导脾淋巴细胞产生IFN- γ影响的对比图；
[0032] 图8Β为不同浓度的Τ7-ΕΑ诱导脾淋巴细胞产生IL-12影响的对比图；
[0033] 图9为式II化合物T7-EA-R0R1、Τ7-ΕΑ、R0R1和对照组分别刺激树突状细胞产生 的细胞因子TNF-α的对比图；
[0034] 图10A为式II化合物T7-EA-R0R1、T7-EA、R0R1和对照组分别刺激树突状细胞产 生的细胞因子IFN-γ的对比图；
[0035] 图10B为式II化合物T7-EA-R0R1、T7-EA、R0R1和对照组分别刺激树突状细胞产 生的细胞因子IL-12的对比图