化合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于多肽/蛋白合成技术领域，具体地，涉及化合物及其制备方法及利用其 制备疏水性膜蛋白/困难序列多肽的方法。
【背景技术】
[0002] 膜蛋白基因组包含了所有哺乳动物基因组的20%~30%，在信号传导、物质运输 以及生物催化方面具有极其重要的作用，大多数膜蛋白都成为现代制药公司研究药物的重 要靶点，在已知药物中约有50%的药物作用靶标是膜蛋白。因此，膜蛋白结构和功能的研究 将为药物的合理设计带来广阔的前景。但是，目前对这些数量庞大的重要膜蛋白的结构-功 能的认识匮乏。这是由于膜蛋白自身的疏水性，很难得到足够量的且纯度较高的膜蛋白用 于晶体和核磁进行结构分析。通过生物重组表达的方法，常常会存在效率差、细胞毒性大等 问题，且无法得到精确修饰的蛋白序列。
[0003] 另一方面，蛋白化学合成技术为获得膜蛋白样品提供了新的途径。蛋白化学合成 技术能实现蛋白的原子尺度的精度的精确调控，得到含D-氨基酸、主链骨架的"氧酯"修饰、 同位素标记、荧光标记、糖基化翻译后修饰等的功能特异性的膜蛋白。例如，诺贝尔奖获得 者MacKinnon和同事通过化学合成得到一个带修饰的钾离子通道K CSAD_Ala77,该修饰将77位 甘氨酸替换为D-型丙氨酸。使用这种人工设计合成的膜蛋白工具，获得了钾离子通道的选 择性的机理。这显示出化学合成膜蛋白的应用前景巨大。
[0004] 但是，当前使用化学合成手段得到的膜蛋白例子极少，膜蛋白样品制备是蛋白化 学合成领域的重大挑战之一。这是因为膜蛋白跨膜肽片段的强疏水性特征以及肽片段形成 的螺旋等二级结构之间的分子间相互作用导致沉聚，导致膜肽片段溶解度极差，造成膜 蛋白跨膜肽片段分离纯化和膜蛋白肽片段连接困难，所以很难得到足够量的且纯度较高的 困难序列多肽和膜蛋白用于结构、功能以及药物的研究。
[0005] 为实现化学合成策略高效获取膜蛋白样品，Kent等人在主链骨架Ν-原子上引入Ν-甲基化修饰，从而破坏膜肽片段的二级结构，从而有效增加膜蛋白的溶解性，但是该修饰基 团无法有效脱除，得不到天然膜蛋白，没有实用价值。为解决骨架修饰的脱除困难问题，我 们在2014年发展了一种可脱除主链骨架修饰策略合成膜蛋白。该策略使用预先制备的甘氨 酸结构单元，通过Fmoc SPPS方法在膜肽片段的主链骨架甘氨酸位点引入可脱除的Arg4_ tag修饰基团，该基团与Fmoc-SPPS兼容，在肽片段合成及多肽连接过程中稳定。但该结构最 后能在与蛋白兼容的温和三氟乙酸(TFA)条件下定量去除，最终得到天然蛋白。被该骨架修 饰基团修饰的疏水性膜蛋白，在合成、纯化、连接以及质谱分析过程中都表现出和水溶性多 肽一样的性状，用于高效的合成中等大小的跨膜蛋白。该策略的一个基本元素是骨架修饰 基团只能在甘氨酸位点引入。但是，并不是所有的膜蛋白在其含跨膜区的多肽片段中含有 Gly。这使得基于Gly位点的RBM策略在实际应用中同样受到了极大的限制。因此，需要发展 在其他位点引入可脱除主链骨架修饰策略的更方便和普适的方法，高效合成膜蛋白。此外， 在Fmoc固相多肽合成过程中，大多数困难序列多肽的合成过程中易形成二级结构(例如β- sheet的结构），使得氨基酸缩合和脱Fmoc保护基的效率低下，最终导致产物纯度差、产率 低。此外，困难序列多肽易形成二级结构发生强烈相互作用而发生聚集，水溶性差，导致在 分离纯化过程中在纯化过程困难。所以困难序列多肽的化学合成是多肽合成领域的一大重 要挑战。例如，AmyloicH3(Ai3)属于困难序列多肽的一种，在多肽合成过程易发生聚集现象， 制备困难。Αβ在阿兹海默症中起重要作用。阿兹海默症是一种与年龄相关的神经退化性疾 病，影响着世界上多数老人的生活。很多研究发现Αβ在神经细胞中的聚集是阿兹海默症的 重要特征之一。Αβ在阿紫海默症发病机理的重要作用，使Αβ成为现代的研究热点。翻译后修 饰、不同长度的派生物以及不同位点突变等对Αβ聚集影响的研究，有可能为阿尔兹海默症 提供新一代的诊断标记和治疗祀点。
[0006] 因此，目前关于制备疏水性膜蛋白以及困难序列多肽的方法仍有待改进。
【发明内容】
[0007] 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商 业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够快速有效地化学合成疏水性膜蛋白和 困难序列多肽的手段。
[0008] 根据本发明的第一方面，本发明一种化合物，其为式（I)所示化合物，该化合物为 2-羟基-5硝基苯甲醛衍生物：
[0009]
[0010] 穴下：1、斤吸f下35;1、乂、」11、4，兀 35#心-1。芳基;1?3为11、(：1-6烷基或(： 6-1。芳基。发明 人经过大量的探索实验和艰苦的劳动，惊奇地发现利用该化合物来制备多肽的方法特别适 合制备疏水性膜蛋白和困难序列多肽，具体地，利用该化合物能够在固相多肽合成的过程 中通过醛氨缩合在氨基酸的氨基上，再经过NaBH4的还原形成亚胺结构，后一个氨基酸通过 该化合物苯环上羟基发生0-N迀移，缩合在氨基上。由于该化合物打破了肽链氨基酸残基 之间的相互作用，进而在多肽制备过程中，能够抑制多肽链的二级结构的形成，即打破了 羰基与氨基之间的氢键相互作用，减少了多肽合成过程中聚集现象的发生。同时，该化合物 的引入使得困难序列多肽合成、分离纯化和表征过程与水溶性蛋白具有类似的处理特性。 由此，能够有效地制备困难序列多肽，并且大大地提高合成纯度，能够大大地减少时间、人 力、物力的消耗。进一步地，利用该化合物，发展了主链可脱除骨架修饰策略进行疏水性膜 蛋白的化学合成。化学合成膜蛋白困难的起因在于膜蛋白中含跨膜区的膜肽片段的溶解度 极差，膜肽片段连接、分离纯化等操作过程非常困难。膜蛋白跨膜肽片段的强疏水性特征以 及肽片段形成的螺旋等二级结构之间的分子间相互作用导致沉聚，导致膜蛋白中含跨膜 区的膜肽片段的溶解度极差。发明人提出了在跨膜区的主链骨架氨基酸的Ν-原子上引入助 溶的Arg-Tag的可脱除骨架修饰策略。含该修饰基团的膜肽序列可以通过Fmoc SPPS合成技 术得到。该修饰基团在不仅可以破坏膜肽/膜蛋白的二级结构，同时引入Arg-Tag基团，也能 有效增加溶解性。该修饰基团在膜肽序列合成、肽片段连接以及分离纯化过程中稳定，从而 简化膜蛋白合成操作，实现膜肽/膜蛋白的增溶作用。完成膜蛋白全长序列的组装后，助溶 Arg-Tag基团又能在三氟乙酸(TFA)条件下定量脱除，最终有效得到天然膜蛋白序列。最后， 在磷脂膜/去垢剂等接近天然的膜蛋白环境中重组复性，得到具有生物功能的膜蛋白。
[0011] 根据本发明的一些实施例，R2为H、甲基、乙基或苯基;R3为H、甲基、乙基或苯基。由 此，利用该化合物能够进一步有效地提高制备困难序列多肽的效率，并且大大地提高合成 纯度，能够大大地减少时间、人力、物力的消耗。
[0012] 根据本发明的一个实施例，所述化合物具有以下结构：
[0013]
由此，利用该化合物能够进一步有效地提高制备困难序列多肽 的效率，并且大大地提高合成纯度，能够大大地减少时间、人力、物力的消耗。
[0014] 根据本发明的第二方面，本发明提供一种制备上述化合物的方法，包括：
[0015] 使式（Π )所示化合物进行硝基化反应，以便获得所述式(I)所示化合物
[0016]
[0017] 其中，R1为Η或者甲基;^为匕&―6烷基或C6-1()芳基;R 3为HA-6烷基或C6-1()芳基。由 此，能够快速有效地制备所述式(I)所示化合物，并且步骤简单、操作方便。
[0018] 根据本发明的一些实施例，R2为H、甲基、乙基或苯基;R3为H、甲基、乙基或苯基。
[0019] 根据本发明的一些实施例，所述方法包括:使所述式（Π )所示化合物与硝基在冰 醋酸溶液中接触，以便获得所述式（I)所示化合物。由此，能够进一步快速有效地制备所述 式(I)所示化合物，并且步骤简单、操作方便。
[0020] 根据本发明的一些实施例，所述方法包括：（1)将冰醋酸和硝酸进行混合，以便获 得第一混合物，并且使得所述第一混合物的温度降至〇°C; (2)于室温下，将2-羟基-4-甲氧 基苯甲醛加入于步骤（1)所获的所述第一混合物中反应12小时，加入冰水淬灭，过滤，以便 获得固体物质；（3)水洗步骤(2)所获得所述固体物质，干燥后，在70°C条件下，于乙醇溶液 中，进行重结晶，以便获得2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛。由此，有利于2-羟基一4-甲氧 基苯甲醛与硝酸的反应，减少副反应，提高反应效率和目标产物的产率。
[0021 ]根据本发明的一些实施例，所述方法包括以下步骤：（1)将31ml冰醋酸和31ml硝酸 进行混合，以便获得第一混合物，并且使得所述第一混合物的温度降至〇°C; (2)于室温下， 将8.4g 2-羟基-4-甲氧基苯甲醛加入于步骤（1)所获得的所述第一混合物中反应12小时， 加入200ml冰水淬灭，过滤，以便获得固体物质；（3)水洗步骤(2)所获得的所述固体物质，干 燥后，在70°C条件下，在50%乙醇溶液中，进行重结晶，以便获得2-羟基-4-甲氧基-5-硝基 苯甲醛。由此，能够高效地制备2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛，且副反应较少，反应效率 和产率较高。
[0022] 根据本发明的第三方面，本发明提出所述化合物或者所述方法制备获得的化合物 在制备疏水性膜蛋白或者困难序列多肽中的用途。
[0023] 根据本发明的一些实施例，所属疏水性膜蛋白为膜蛋白甲流感病毒离子通道蛋白 M2的跨膜区M2-TM，所述困难序列多肽为Amy 1 〇 i d-β。
[0024] 根据本发明的第四方面，本发明提出一种制备Amy 1 〇 i d-邱勺方法，包括：
[0025] (a-Ι)使2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛与式(al)所示固相树脂上的多肽接触， 以便获得式(a2)所示固相树脂上的多肽
[0026]
[0027] (a-2)在DMF溶液中，使所述式(a2)所示固相树脂上的多肽与NaBH4进行还原反应， 以便获得式(a3)所示固相树脂上的多肽
[0028]
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[0029] (a-3)利用Fmoc固相合成法继续延长所述式(a3)所示固相树脂上的多肽，以便获 得式(a4)所示固相树脂上的多肽
[0030]
[0031] (a-4)在含有体积比0.1%HC1的DMF溶液中，使所述式(a4)所示固相树脂上的多肽 与SnCl2进行还原反应，以便获得式(a5)所示固相树脂上的多肽
[0032] 发明人采用SnCh/HCl将所述式 )， (a4)所示固相树脂上的多肽上的硝基还原成氨基可使Gly缩合上去；
[0033] (a-5)利用Fmoc固相合成法将式（a5)所示固相树脂上的多肽连接上Gly-Arg4_ tag，以便获得式(a6)所示固相树脂上的多肽
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