>[0158]
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[0160] 首先，将Novel PEG Wang树脂加入多肽合成管，用二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷 (DCM)(体积比1:1)溶胀30分钟，接着，偶联B1多肽片段的C端的第一个氨基酸采用的操作包 括:将4倍当量的Fmoc保护的B1多肽片段的C端的第一个氨基酸，4倍当量的DIC以及4倍当量 Oxyma溶于DMF溶液中，加入到含有经过溶胀的树脂的多肽合成管中反应8小时，将所得到的 树脂依次用DMF、DCM、DMF各洗涤三次。将4倍当量的Fmoc保护的B1多肽片段的C端第一个的 氨基酸，4倍当量的DIC，4倍当量Oxyma以及催化量的DMAP溶于DMF溶液中，加入到含有经过 溶胀的树脂的多肽合成管中反应2小时，将所得到的树脂依次用DMF、DCM、DMF各洗涤三次。 然后用掩蔽试剂(醋酸酐:DIEA: DMF = 1:1:8)浸泡树脂10分钟后，再依次用DMF、DCM、DMF各 洗涤树脂三次。接下来，加入20%哌啶的DMF溶液处理树脂5分钟和10分钟后，依次用DMF、 DCM、DMF各洗涤树脂三次，再将现配制的混合液(3.6当量的HBTU，4当量HOBt，8当量DIEA和4 当量Fmoc保护的B1多肽片段的C端第二个氨基酸)加入树脂反应两次，每次60分钟，依次用 DMF、DCM、DMF各洗涤树脂三次后，用20 %哌啶的DMF溶液处理5分钟和10分钟，接下来的氨基 酸的缩合重复上面的操作，以便获得式(bl)所示固相树脂上的多肽。预先将1.5倍的2-羟 基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛与被脱了 N端Fmoc的式(bl)所示固相树脂上的多肽反应1小时。 再用4倍的NaBH4的DMF溶液还原两次，每次5分钟，以便获得式(b3)所示固相树脂上的多肽。 式(b3)所示固相树脂上的多肽中被修饰的丙氨酸的后一个氨基酸通过两次DIC/0xyma缩 合，每次4~5小时，通过Fmoc固相合成技术继续延长多肽并在多肽N端连上Boc氨基酸，从而 获得式（b4)所示固相树脂上的多肽。将所得的（b4)所示固相树脂上的多肽用SnCl2/ 0.001HC1的DMF溶液还原多肽修饰基团上的硝基，从而获得式(b5)所示固相树脂上的多肽。 通过Fmoc固相合成技术在式(b5)所示固相树脂上的多肽中被还原的修饰基团上的氨基上 连Gly-Arg4_tag，从而获得式(b6)所示固相树脂上的多肽。最后用乙酸酐:DIEA:DMF=1:1: 8对式(b6)所示固相树脂上的多肽修饰基团上的羟基进行乙酰化，以便获得式(b7)所示固 相树脂上的多肽片段。待目标多肽固相合成结束后，将所得到的树脂分别用大量DMF、DCM 洗涤，真空干燥后，外加 l〇ml酸性切割试剂(88 %三氟乙酸，5 %苯酚，5 %水，2 %三异丙基硅 烷），处理2-4小时。浓缩含有目标多肽的酸性切割试剂，外加8当量的冰冻乙醚沉淀，然后离 心获得粉末状粗肽。利用制备型高效液相色谱(HPLC)对粗肽进行分离纯化处理，然后经真 空冷冻干燥，获得高纯度的B1多肽片段，经质谱确定结构正确。制备获得的B1多肽片段的质 谱和色谱图分别如图9所示。
[0161]制备B2多肽片段
[0162] 将81多肽片段(3.711^，1以111〇1，1叫)溶于11111含有0.41〇 78的!120:乙腈=1:1缓冲溶 液，调节pH至7.0后，将反应瓶置于37°C下反应1小时后，反应完全将B1多肽片段中修饰基团 上的羟基上的乙酰基脱去，即得B2多肽片段，相应的B2多肽片段的色谱及质谱图见图10。
[0163] 制备B3多肽片段
[0164] 将82多肽片段（3.611^，1以111〇1，169)加11111酸性切割试剂(95%三氟乙酸，2.5%水， 2.5 % TIPS )，处理2-4小时。浓缩含有目标多肽的酸性切割试剂，外加8当量的冰冻乙醚沉 淀，然后离心获得粉末状粗肽。利用制备型高效液相色谱(HPLC)对粗肽进行分离纯化处理， 然后经真空冷冻干燥，获得高纯度的目标多肽片段，经质谱确定结构正确。制备获得的B3多 肽片段的质谱和色谱图分别如图11所示。完成了全长的家流感病毒离子通道蛋白M2的跨膜 区M2-TM的化学全合成，多肽总分离产率为24%，纯度大于90 %。
[0165] 在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。
[0166] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种化合物，其特征在于，其为式(I)所示化合物：其中，R1为Η或甲基； R2为Η、&-6烷基或C6-1Q芳基； R3为Η、&-6烷基或C6-1Q芳基。2. 根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，R2为H、甲基、乙基或苯基;R3为H、甲基、乙 基或苯基。3. 根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有以下结构： 、〇4. 一种制备权利要求1-3任一项所述化合物的方法，其特征在于，包括： 使式（Π )所示化合物进行硝基化反应，以便获得所述式(I)所示化合物其中，R1为Η或者甲基； R2为Η、&-6烷基或C6-1Q芳基； R3为Η、&-6烷基或C6-1Q芳基； 任选地，R2为H、甲基、乙基或苯基； 任选地，R3为H、甲基、乙基或苯基。5. 根据权利要求4所述方法，其特征在于，包括： 使所述式（Π )所示化合物与硝基在冰醋酸溶液中接触，以便获得所述式（I)所示化合 物。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，包括： (1) 将冰醋酸和硝酸进行混合，以便获得第一混合物，并且使得所述第一混合物的温度 降至0°C; (2) 于室温下，将2-羟基-4-甲氧基苯甲醛加入于步骤（1)所获的所述第一混合物中反 应12小时，加入冰水淬灭，过滤，以便获得固体物质； (3) 水洗步骤(2)所获得所述固体物质，干燥后，在70°C条件下，于乙醇溶液中，进行重 结晶，以便获得2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛。7. 权利要求1-3任一项所述的化合物或者权利要求4-6任一项所述方法制备获得的化 合物在制备疏水性膜蛋白或者困难序列多肽中的用途。8. 根据权利要求7所述的用途，所属疏水性膜蛋白为膜蛋白甲流感病毒离子通道蛋白 M2的跨膜区M2-TM，所述困难序列多肽为Amy 1 〇 i d-β。9. 一种制备Amyloid-β的方法，其特征在于，包括： (a-Ι)使2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛与式(al)所示固相树脂上的多肽接触，以便 获得式(a2)所示固相树脂上的多肽(a-2)在DMF溶液中，使所述式(a2)所示固相树脂上的多肽与NaBH4进行还原反应，以便 获得式(a3)所示固相树脂上的多肽、fcW Z ， (a-3)利用Fmoc固相合成法继续延长所述式(a3)所示固相树脂上的多肽，以便获得式 (a4)所示固相树脂上的多肽(a-4)在含有体积比0.1 %HC1的DMF溶液中，使所述式(a4)所示固相树脂上的多肽与 SnCl2进行还原反应，以便获得式(a5)所示固相树脂上的多肽(a-5)利用Fmoc固相合成法将式(a5)所示固相树脂上的多肽连接上Gly-Arg4_tag,以便 获得式(a6)所示固相树脂上的多肽(a-6)对式(a6)所示固相树脂上的多肽进行乙酰化，以便获得式(a7)所示固相树脂上 的多肽(a-7)采用TFA将所述式(a7)所示固相树脂上的多肽从固相树脂上切下来，以便获得式 (A1)所示的A1多肽片段(b) 脱去所述A1多肽片段中的乙酰基，以便获得式(A2)所示的A2多肽片段(c) 使得所述A2多肽片段与式(A3)所示的A3多肽片段进行连接反应，以便获得式(A4) 所示的A4片段 H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKG-SCH2CH2S03H(A3)(d) 对所述A4多肽片段进行脱硫处理，以便获得式(A5)所示的A5多肽片段(e)采用TFA处理所述A5多肽片段，以便获得式(A6)所示的Amyloid-β H-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA-〇H(A6)〇10.-种制备甲流感病毒离子通道蛋白M2的跨膜区M2-TM的方法，其特征在于，包括： (a) 使得2-羟基-4-甲氧基-5-硝基苯甲醛与式(bl)所示固相树脂上的多肽接触，以便 获得式(b2)所示固相树脂上的多肽(b) 在DMF溶液中，使所述式(b2)所示固相树脂上的多肽与NaBH4进行还原反应，以便获 得式(b3)所示固相树脂上的多肽(c) 利用Fmoc固相合成法继续延长所述式（b3)所示固相树脂上的多肽，以便获得式 (b4)所示固相树脂上的多肽(d) 在含有体积比0.1 %HC1的DMF溶液中，使所述式(b4)所示固相树脂上的多肽与SnCl2 进行还原反应，以便获得式(b5)所示固相树脂上的多肽(e) 利用Fmoc固相合成法将式(b5)所示多肽连接上Gly-Arg4_tag，以便获得式(b6)所示 固相树脂上的多肽V DO (f) 对所述式(b6)所示多肽进行乙酰化，以便获得式(b7)所示固相树脂上的多肽片段(g) 用TFA将固相树脂上的多肽从树脂上切下来，以便获得式(B1)所示的B1多肽片段(h) 脱去所述B1多肽片段中的乙酰基，以便获得式(B2)所示的B2多肽片段(i)采用TFA处理所述B2多肽片段，以便获得式(B3)所示的家流感病毒离子通道蛋白M2 的跨膜区M2-TM H-SSDPLWAASIIAILHLILWILDRL-OH(B3)。
【专利摘要】本发明涉及化合物及其制备方法和应用，具体地，提供了一种2-羟基-5硝基苯甲醛衍生物，其为式(Ⅰ)所示化合物，其中，R1为H或甲基；R2为H、C1-6烷基或C6-10芳基；R3为H、C1-6烷基或C6-10芳基。在多肽制备过程中，利用该化合物能够打破肽链氨基酸残基之间的相互作用，进而能够抑制多肽链的二级结构的形成，打破羰基与氨基之间的氢键相互作用，减少了多肽合成过程中聚集现象的发生，使得难溶性多肽片段的合成、分离纯化和表征过程与常规水溶性多肽类似，从而可以高效制备困难序列多肽。
【IPC分类】C07C205/44, C07K1/02, C07K1/04, C07K14/11, C07K14/47, C07C201/08
【公开号】CN105622424
【申请号】CN201610083843
【发明人】刘磊, 郑基深, 左超, 唐姗, 田长麟
【申请人】清华大学
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年2月6日