24h，T7-EA 终浓度为 4 ymol/L，T7-EA-R0R1 组按照T7-EA与R0R1摩尔比1:1混合，第7天收细胞，1400rpm，5min，4°C离心，收上清测因 子TNF- α，按照ELISA试剂盒说明书进行操作。结果如图9所示，从细胞因子TNF- α的量 来看，T7-EA-R0R1组与对照组PBS相比有明显差异（Ρ < 0. 01)，T7-EA-R0R1组与R0R1组 相比也有明显的差异（Ρ < 0. 01)。
[0092] 式II化合物研究实施例4 :ELISA检测T7-EA-R0R1刺激脾淋巴细胞产生的细胞因 子 IFN-γ、IL-12
[0093] 提取小鼠脾淋巴细胞具体操作方法同式II化合物的研究实施例2, T7-EA终浓 度为4 μ mol/L，T7-EA-R0R1组按照T7-EA与R0R1摩尔比1:1混合，第2天收上清测因子 IFN- γ、IL-12按照ELISA试剂盒说明书进行操作。结果如图10A和10B所示，对照组PBS 和R0R1组不能诱导脾淋巴细胞产生细胞因子IFN-γ和IL-12，T7-EA组、T7-EA-R0R1组诱 导脾淋巴细胞产生了细胞因子IFN-γ和IL-12与对照组PBS、R0R1组相比有统计学差异（P < 0· 01) 〇
[0094] 式II化合物研究实施例5 :抗肿瘤动物实验
[0095] 36只4~5周龄早BALB/c小鼠在动物房SPF级检疫1周后进行荷瘤，接种乳腺 癌4T1细胞数量为2 X 105/只，长出瘤的小鼠随机分为PBS对照组、T7组、EA组、T7-EA组、 R0R1组、T7-EA-R0R1组，待瘤直径达到5mm左右，腹腔给药进行免疫治疗，每周一次，共免 疫治疗4次，最后一次免疫治疗后的第6天处死小鼠取其脾脏和肿瘤。肿瘤体积大小按下 列公式计算：V = ab2/2 (a为长径b为短径）。实验结果如图11A-11C所示，T7-EA-R0R1组 与R0R1组和对照组PBS相比肿瘤增长速度明显减慢，差异具有统计学意义（P < 0. 01)，与 T7-EA组相比，T7-EA-R0R1组肿瘤增长速度也明显减慢（P < 0. 05)。肿瘤重量大小与肿瘤 生长情况相符，T7-EA-R0R1组肿瘤的重量明显小于PBS组（P < 0. 01)，与T7-EA组相比， T7-EA-R0R1组肿瘤的瘤重明显减小（P < 0. 05)，T7-EA-R0R1组肿瘤重量也明显小于R0R1 组（P < 0· 05) 〇
[0096] 式II化合物研究实施例6 :全细胞抗体的测定
[0097] 按照BCA蛋白定量试剂盒说明书操作提取乳腺癌4T1细胞的蛋白并测其浓度，提 取的蛋白作为包被抗原，每次免疫治疗后的第6天采集小鼠的静脉血，并取其上清，共采 集4次，血清抗体的测定按照ELISA试剂盒说明书进行操作。结果如图12所示，T7-EA组 和T7-EA-R0R1组小鼠的血清中IgG抗体的水平随着免疫次数的增加逐渐升高。从抗体 IgG产生的量来看，T7-EA-R0R1组与PBS组相比有显著性差异（P < 0. 01)，与R0R1组相比 T7-EA-R0R1组产生的IgG抗体有明显差异（P < 0. 05)，由以上结果可知，T7-EA提高了 R0R1 的免疫原性，T7-EA-R0R1诱导机体产生了体液免疫反应。
[0098] 式II化合物研究实施例7 :细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL) 活性检测
[0099] CTL活性测定采用乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase, LDH)法，具体操作按照 LDH试剂盒说明书进行。小鼠脾淋巴细胞提取的具体操作方法同式II化合物研究实施例 2,提取的脾淋巴细胞为效应细胞，乳腺癌4T1细胞为靶细胞，效应细胞：靶细胞=25: 1，共 孵育4h，杀伤率按下列公式计算：杀伤率（％)=(实验组0D值-效应细胞自发0D值-靶 细胞自发0D值）八靶细胞最大00值-靶细胞自发00值）\100%。结果如图13所示，从 对4T1的杀伤率来看，T7-EA-R0R1组与对照组相比效应细胞对靶细胞4T1有明显的杀伤作 用（P < 0. 01)，与T7-EA组和R0R1组相比，T7-EA-R0R1组的杀伤率明显较高（P < 0. 05)， 这说明T7-EA与R0R1相结合可以更好的激发细胞免疫，从而增强疫苗对靶细胞的杀伤性。
[0100] T7-EA刺激脾淋巴细胞产生细胞因子IFN- γ和IL-12 (图8A和8B)，这些数据表 明，Τ7-ΕΑ具有激发先天性免疫的功能。其实验的结果（图9、图10Α和10Β)表明R0R1的 免疫原性较弱不能激发先天性免疫，然而，Τ7-ΕΑ与R0R1结合后使疫苗更好的激发先天性 免疫。肿瘤生长情况（图11Α、图11C)和肿瘤重量（图11Β)的结果表明，Τ7-ΕΑ与R0R1结 合后明显减慢了肿瘤的增长。
[0101] TLR7在免疫细胞中有表达，比如巨噬细胞、树突状细胞和Β淋巴细胞，TLR7与其激 动剂结合后，TLR7依赖的MyD88信号通路被激活产生细胞因子，诱导活化树突状细胞，从而 更好的活化B细胞、T辅助细胞，激发机体产生免疫效应。该实验的CTL结果（图13)表明 T7-EA与R0R1结合后在激发先天性免疫的同时促进T细胞的活化，从而更好杀伤靶细胞， 全细胞抗体效价的结果（图12)表明T7-EA-R0R1诱发机体产生了乳腺癌特异性IgG抗体。 这些数据说明T7-EA与R0R1结合后，使疫苗更好激发细胞免疫和体液免疫。
[0102] 综上所述，式II的化合物T7-EA-R0R1、明显减慢了 4T1乳腺癌皮下移植瘤的生长， 该实验证明了 T7-EA-R0R1具有抗乳腺癌的作用且与激发机体的先天性免疫和适应性免疫 有关，同时证明了 T7-EA具有激发先天性免疫和适应性免疫的功能，也有免疫佐剂的作用。
[0103] 应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种式I的化合物，具有如下结构式：2. 权利要求1所述的式I化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 51、 将第一反应物溶于反应溶剂中，加入皿TU苯并Ξ氮挫-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脈六氣憐酸盐、Ξ乙胺和催化 剂4-二甲氨基化晚，室溫下揽拌反应； 52、 反应完成后将反应液倒入水中，抽滤，滤渣经水洗、干燥得到式I的化合物。3. 根据权利要求2所述的式I的化合物的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所 述第一反应物、第二反应物、皿TU苯并Ξ氮挫-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脈六氣憐酸盐和Ξ 乙胺W下述摩尔比份数进行反应：第一反应物4-12份、第二反应物5-15份、苯并Ξ氮 挫-Ν，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脈六氣憐酸盐5-15份W及Ξ乙胺18-30份。4. 根据权利要求2所述的式I的化合物的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述反 应溶剂选自四氨巧喃、甲苯、苯、Ν，Ν-二甲基甲酯胺、Ν，Ν-二甲基乙酷胺和Ν-甲基化咯烧酬 中的任意一种或多种。5. 根据权利要求2所述的式I的化合物的制备方法，其特征在于，步骤S1的反应时间 为8-24小时。6. 根据权利要求2所述的式I的化合物的制备方法，其特征在于，在步骤S2后还包括 步骤S3 :将得到的式I的化合物经柱层析分离进行纯化，其中柱层析分离所用溶剂为二氯 甲烧和甲醇的混合溶剂，二氯甲烧与甲醇的体积比为20:1。7. 权利要求1所述的式I的化合物在制备用于预防和免疫治疗黑色素瘤引起的皮肤癌 的药物中的用途。8. 由权利要求1所述的式I的化合物制备得到的式II的化合物，具有如下结构式：9.权利要求8所述的式II的化合物的制备方法，其特征在于，将第Ξ反应物溶于二甲 基亚讽中，加入式I的化合物，室溫揽拌8-24小时，利用液相色谱-质谱联用监测反应，审U 备液相色谱分离，得到式II的化合物； 其中，第Ξ反应物为R0R1，其结构式如下：第Ξ反应物与式I的化合物的反应摩尔配比为1 :1。10. 权利要求8所述的式II的化合物在制备用于预防和免疫治疗乳腺癌的药物中的用 途。
【专利摘要】本发明涉及化合物I和化合物II及其制备方法和应用，其中新合成的式I的化合物在大大提高利尿酸(EA)的抗肿瘤效果上，能够激发抗肿瘤的先天性免疫和细胞免疫，探索了抗肿瘤免疫协同一体化的药物设计；证明了式I的化合物抗黑色素瘤的免疫反应机制；由式I的化合物与ROR1共价制备的式II的化合物明显减慢了乳腺癌皮下移植瘤的生长，证明式II的化合物治疗乳腺癌的免疫反应机制，同时证明了式I的化合物不仅具有激发先天性免疫和适应性免疫的功能，还具有有免疫佐剂的作用。
【IPC分类】A61P35/00, C07K14/705, C07D473/18, C07K1/107
【公开号】CN105315281
【申请号】CN201510786141
【发明人】靳广毅, 王竹林, 胡云龙, 刘兵
【申请人】深圳大学, 深圳市康居正医药科技有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月16日