三角帆蚌微卫星标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及一种三角帆蛛微卫星分子标 记及其应用。
【背景技术】
[0002] 微卫星DNA，又称为短串联重复序列或简单序列重复。它是以1-6个碱基的短核苷 酸为基本单位首尾相连组成串联重复序列，由于重复次数不同以及重复程度的不完全造成 了每个位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，再经 电泳分析，即可显示不同基因型个体微卫星的多态性。微卫星由于分布广泛，密度大，多态 性丰富，遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于PCR扩增，所需DNA数量极少，对DNA质量 要求不高，结果重复性好等优点，目前已被广泛应用于遗传多样性、亲缘关系分析、连锁图 谱构建、功能基因定位、分子标记辅助育种等领域。
[0003] 三角帆蛛隶属于体动物门（Mollusca)，双壳纲（Bivalvia)，蛛目（Unionida)，虫丰 科（Unionidae)，帆蛛属（Hyriopsis)，另lj名三角蛛、水壳等。三角帆蛛为我国特有种，分布 于河北、山东、安徽、江苏、浙江、江西、湖北和湖南等省大、中、小型湖泊及其周围河流内。三 角帆蛛（Hyriopsiscumingii)是我国最主要的淡水经济贝类之一，也是我国主要的淡水育 珠蚌，其每年的淡水珍珠产量占世界的95%以上。但由于过度开发、环境污染等原因，三角 帆蚌资源显著减少，因此，保护天然种质资源是开展三角帆蚌育种的基础。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种三角帆蚌微卫星标记及其扩增引物，为三角 帆蚌的种群遗传学、家系鉴定及分子标记辅助育种提供有效的工具。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种三角帆蚌微卫星标记，该三角帆蚌微卫 星标记的核苷酸序列为SEQIDN0 :1、或SEQIDN0 :2所述；或为上述核苷酸序列的互补序 列；
[0006] 所述SEQIDN0 :1对应微卫星位点Hcl，所述SEQIDN0 :2对应微卫星位点Hc2。
[0007] 作为本发明的三角帆蚌微卫星标记的改进：三角帆蚌微卫星标记的特异性引物对 为如下任一所示：
[0008] 微卫星位点Hcl特异性引物：F:CTGCATAAGGGCACATGATTTA
[0009] R：TGTTTGCAGCTAAAATGAGG
[0010] 微卫星位点Hc2 特异性引物：F:GGTTTGCCTTCTACGAAAGATG
[0011] R:CCCCAAATGTTTTTATGACCAG。
[0012] 本发明还同时提供了上述三角帆蚌微卫星标记的用途：可用于检测三角帆蚌种群 遗传多样性、分析三角帆蚌亲缘关系、三角帆蚌辅助育种的工具（即，对三角帆蚌进行遗传 分析、种质资源调查或辅助育种）。
[0013] 作为本发明的三角帆蚌微卫星标记的用途的改进：利用引物对检测三角帆蚌种群 遗传多样性的方法包括如下步骤：
[0014] 1)、提取三角帆蚌外套膜基因组DNA(可采用酚-氯仿法）；
[0015] 2)、微卫星PCR扩增：
[0016] 采用微卫星位点Hcl特异性引物或者微卫星位点Hc2特异性引物，以三角帆蚌基 因组DNA为模板进行PCR，从而获得三角帆蚌个体微卫星扩增产物；
[0017] 3)、利用测序仪检测扩增产物（具体为：将扩增产物用BiopticQs印100测序仪进 行电泳和STR分析）；
[0018] 4)、遗传多样性分析：根据每个三角帆蚌个体的微卫星扩增产物的分子量大小确 定基因型，采用CERVUS3. 0和P0PGENE3. 2计算遗传多样性参数。
[0019] 在本发明中，微卫星DNA分子标记引物的获得方法如下：
[0020] 1)、三角帆蚌转录组测序提取三角帆蚌外套膜的总RNA，经mRNA富集、片段化 mRNA、合成cDNA、末端修复以及加"A"连接工序，建立测序文库，采用IlluminaHiSeq?2500 测序，获得三角帆蚌原始序列；
[0021] 2)、三角帆蚌Unigene的获得及微卫星位点的检测：将转录组测序获得的原始序 列去除接头和Q值< 10的低质量片段序列后获得高质量序列，高质量序列进行从头组装得 到三角帆蛛的Unigene，然后在Unigene序列中用软件MISA进行微卫星位点查找，得到多个 微卫星位点；
[0022] 3)、对筛选得到的微卫星位点用BatchPrimer3软件依据本发明的特定要求进行 批量引物设计，从设计成功的引物中选取后进行多态性验证。
[0023] 引物对设计参数为：引物长度18-22bp，PCR产物片段长度范围100-300bp，最适退 火温度55-65°C，GC含量40% -60%之间。
[0024] 综上所述，本发明提供2个微卫星标记，本发明还提供分别用于扩增上述2个微卫 星标记的引物对；Hcl-F和Hcl-R的引物对用于扩增核苷酸序列如SEQID:1所示的微卫星 标记（Hcl)，Hc2-F和Hc2-R的引物对用于扩增核苷酸序列如SEQID:2所示的微卫星标记 (Hc2)。本发明从三角帆蚌基因组DNA中筛选2个微卫星标记，根据微卫星重复序列两端的 侧翼区设计特异性引物并进行扩增，获得的扩增产物具有高度的多态性，可用于三角帆蚌 的群体遗传学、亲缘关系分析、分子标记辅助育种等领域。
【具体实施方式】
[0025] 实施例1、
[0026] 1、含有微卫星重复单元的序列的查找
[0027] 从构建的三角帆蚌转录组文库的序列中用MISA软件进行微卫星重复单元序列的 查找；参数设置为查找含有一碱基重复10次以上，二碱基重复次数6次以上，三、四、五、六 碱基重复次数5次以上的序列。共筛选出16179个含有微卫星重复单元的序列，并从中设 计引物进行多态性的检测。
[0028] 2、微卫星引物的设计
[0029] 从含有微卫星重复单元的基因序列中，选取符合引物设计的序列使用Batch Primer3进行批量引物设计。主要参数设置为：引物长度18-22bp，PCR产物片段长度范围 100-300bp，最适退火温度55-65°C，GC含量40 % -60 %之间，尽量避免二级结构的出现。
[0030] 3、对设计的引物的扩增产物进行多态性检测：
[0031]1)、基因组DNA的提取：
[0032] 采用酚-氯仿法提取30个三角帆蚌外套膜组织的基因组DNA;
[0033] 2)、微卫星PCR扩增：
[0034] 用上述设计的引物扩增三角帆蚌基因组DNA;反应体系25μL:模板DNA 1μL(10ng/μL)，正反向引物各 1μL，MixTaq酶 12. 5μL，无菌水 9. 5μL。
[0035]PCR反应在S1000?ThermalCycler仪中进行，扩增程序如下：94°C预变形4min; 94°C变性30s，退火温度（Hcl引物：58°C，Hc2引物：60. 3°C)下复性lmin，72°C延伸lmin， 30个循环；最终72°C延伸lOmin。
[0036]3)、测序仪检测扩增产物：
[0037] 将扩增产物在BiopticQs印100测序仪上进行电泳和STR分析以确定三角帆蚌微 卫星标记在不同个体上的等位基因大小。
[0038] 4)、遗传多样性分析：
[0039] 根据每个微卫星扩增产物的等位基因大小确定基因型，采用CERVUS3.0和 P0PGENE3. 2计算遗传多样性参数，从而筛选出具有多态性的微卫星引物及对应的微卫星 记D
[0040] 经过多样性检测，本发明筛选了2个具有遗传多态性的微卫星标记，其核苷酸序 列如SEQIDN0:1、SEQIDΝ0:2所示，其所对应的扩增引物的信息如表1所示。
[0041]表1、三角帆蚌微卫星标记及其对应的引物
[0042]
[0043] 如表2所示，在30个三角帆蚌样本中对上述2个微卫星标记进行遗传多样性分析 的结果表明：两个微卫星标记的等位基因数分别为20和8个，平均等位基因数目为14个， 观测杂合度分别为1. 〇〇〇和〇. 3333,期望杂合度分别为0. 9390和0. 7864,PIC(Polymorphic informationcontent，多态性信息含量）是衡量基因变异程度高低的指标，当PIC值>0. 5 时，该基因座位为高度多态性；0. 25 <PIC< 0. 5时，为中度多态性；PIC小于0. 25时为低 度多态性，两个微卫星标记的PIC值分别为0. 9184和0. 7431，说明这两个微卫星标记具有 高度多态性。从而证明本发明筛选的微卫星标记的引物具有遗传多态性。
[0044] 表2、2个微卫星标记的遗传特征（Ta:退火温度；NA:等位基因数目；H0:观测杂 合度；HE:期望杂合度；PIC〖polymorphicinformationcontent，多态信息含量；P-HWE: Hardy-Weinbergequilibrium，哈迪温伯格平衡检验）
[0045]
[0046] 注：表中的*表示显著偏离哈迪-温伯格平衡。
[0047] 因此，本发明的微卫星标记及其扩增引物还可用于三角帆蚌遗传多样性、亲缘关 系分析及分子标记辅助育种等领域研究。
[0048] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 三角帆蚌微卫星标记，其特征是：三角帆蚌微卫星标记的核苷酸序列为SEQIDNO: 1、或SEQIDNO:2所述；或为上述核苷酸序列的互补序列； 所述SEQIDN0:1对应微卫星位点Hcl，所述SEQIDN0:2对应微卫星位点Hc2。2. 根据权利要求1所述的三角帆蚌微卫星标记，其特征是：三角帆蚌微卫星标记的特 异性引物对为如下任一所示： 微卫星位点Hcl特异性引物：F:CTGCATAAGGGCACATGATTTA R：TGTTTGCAGCTAAAATGAGG 微卫星位点Hc2特异性引物：F:GGTTTGCCTTCTACGAAAGATG R:CCCCAAATGTTTTTATGACCAG。3. 根据权利要求1或2所述的三角帆蚌微卫星标记的用途，其特征是：可用于检测三 角帆蚌种群遗传多样性、分析三角帆蚌亲缘关系、三角帆蚌辅助育种的工具。4. 根据权利要求3所述的三角帆蚌微卫星标记的用途，其特征是：利用引物对检测三 角帆蚌种群遗传多样性的方法包括如下步骤： 1) 、提取三角帆蚌外套膜基因组DNA; 2) 、微卫星PCR扩增： 采用微卫星位点Hcl特异性引物或者微卫星位点Hc2特异性引物，以三角帆蚌基因组DNA为模板进行PCR，从而获得三角帆蚌个体微卫星扩增产物； 3) 、利用测序仪检测扩增产物； 4) 、遗传多样性分析：根据每个三角帆蚌个体的微卫星扩增产物的分子量大小确定基 因型，采用CERVUS3. 0和P0PGENE3. 2计算遗传多样性参数。
【专利摘要】本发明公开了一种三角帆蚌微卫星标记，该三角帆蚌微卫星标记的核苷酸序列为SEQ？ID？NO：1、或SEQ？ID？NO：2所述；或为上述核苷酸序列的互补序列；所述SEQ？ID？NO：1对应微卫星位点Hc1，所述SEQ？ID？NO：2对应微卫星位点Hc2。三角帆蚌微卫星标记的特异性引物对为如下任一所示：微卫星位点Hc1特异性引物、微卫星位点Hc2特异性引物。其用途为：可用于检测三角帆蚌种群遗传多样性、分析三角帆蚌亲缘关系、三角帆蚌辅助育种的工具。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105420234
【申请号】CN201510933465
【发明人】郑荣泉, 毛媛媛
【申请人】浙江师范大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月15日