一种巨魾鱼微卫星标记开发的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于动物微卫星标记技术领域。
【背景技术】
[0002]巨魅7arri?77i Sykes)属于鲇形目，姚科，魅属。中国分布在云南省的元江、澜沧江、怒江；近年来，随着环境的变迀、经济的发展、鱼类捕捞强度逐步加大，使得鱼类的种类、数目都急剧减少，导致种群内亲缘关系接近的个体交配的几率大大增加，遗传多样性明显下降，因此利用微卫星分子标记技术来对巨魅鱼的群体遗传结构、不同群体的遗传变异进行标记，以对此鱼类的种质资源进行保护，为以后的人工养殖及繁殖提供基础数据就显得日益迫切。但是目前巨魅鱼类的微卫星标记尚未见报道。
[0003]微卫星是指由l_6bp核苷酸为重复单元组成的短串连重复(Short tandemrepeats)或简单重复序列(Simple Sequence Repeat, SSR)，又称为微卫星DNA。微卫星分子标记符合孟德尔遗传规律，是分析物种遗传多样性的重要方法，微卫星分子标记具有多态性丰富、分布广、重复性好、呈共显性遗传等特点，已成为第二代分子标记的代表。而开发出物种特有的微卫星标记是进行微卫星标记的前提条件。开发微卫星引物的方法有经典的构建与筛选基因组文库的方法、微卫星富集法、省略筛库法和数据库搜索法等四种，这些方法都存在不同的缺陷，比如经典的构建与筛选基因组文库的方法中存在程序复杂，如果测序片段大则测序困难，而小片段的又存在成功率低；微卫星富集法仍然需要构建文库，操作繁琐，成本较高；省略筛库法开发出的引物特异性低；数据库搜索法由于许多物种至今还没有公开的DNA序列，限制了这种方法的应用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种花费时间短、费用较低、精度高、覆盖范围广从而效率较高的巨魅鱼微卫星标记开发的方法。
[0005]本发明的目的通过如下技术方案实现。
[0006]巨魅鱼微卫星标记开发的方法，方法步骤如下:
(1)剪取巨魅活鱼的肌肉或者肝脏等组织各5克混合，放于干冰寄测序公司或者-80°c冰箱保存；
(2)进行总RNA提取，步骤如下:
1)取0.1g混合组织在液氮中充分研磨，移入ImL Trizol中，混匀后室温下静置5min，使核蛋白复合物完全解离；
2)加入0.2mL氯仿，剧烈摇动或用旋祸震荡器混勾，4°C下12000rpm离心15min ；
3)吸取上清液；
4)在吸取的上清液中，每ImLTrizol加入500 μ I的异丙醇，充分混勾后，于室温放置1min ；
5)在40CT12000rpm离心lOmin，倒掉上清液; 6)收集RNA沉淀，用75%的乙醇洗涤两次，重复上述步骤5)的离心过程；
7)用一次性吸头吸尽残存的乙醇，将打开管盖的离心管置放于实验台上，使残余的乙醇挥发掉，不要让RNA干透；
8)加入适量RNase-Free的超纯水，将RNA沉淀充分溶解；
(3)用核算测定仪进行RNA纯度检测，以260/280比值来鉴定其质量；
(4)利用TakaraM-MLV反转录试剂盒进行cDNA的合成，步骤如下:
1)取测定浓度的RNA溶液，取含有Iμ gRNA的溶液，加入I μ I的浓度为25 μ M的随机引物，加RNase-Free的水补充体积到6 μ I ;
2)混合均匀后，将混合液置于70°C加热1min;
3)取出样品，放置在冰上2min，冷却；
4)依次加入2 μ I 的 5XM-MLV buffer,0.5 μ I 的浓度为 1mM 的 dNTP、0.25 μ I 的浓度为40U/ μ I的RNase抑制剂、200U的M-MLV反转录酶，加水补齐到10 μ 1，混匀；
5)将混匀的液体置于30°C加热10min，42°C加热lh，70°C加热15min；
(5)送测序公司的测序仪进行转录组测序；
(6)序列整理，得到DNA序列表；
(7)利用软件找出微卫星序列，在核心序列两侧设计引物并合成；
(8)利用温度梯度PCR进行引物退火温度的优化:根据引物合成公司的引物合成时的温度±5°C进行退火温度的筛选，扩增出引物设计时的目的片段的大小；
(9)利用4条巨魅提取的DNA进行PCR扩增后进行非变性聚丙烯酰胺胶电泳，利用凝胶成像分析仪进行条带分析，有多条带的为多态性微卫星引物；
本发明所述巨魅鱼微卫星标记开发的方法的应用，可利用筛选出来的多态性微卫星引物对待分析的鱼的DNA顺序进行PCR扩增、进行非变性聚丙烯酰胺胶电泳、凝胶成像分析仪进行条带分析、进行条带多态性评估，得到巨魅的遗传结构，对巨魅的遗传多样性进行评估。
[0007]本发明利用转录组测序方法，对巨魅鱼微卫星标记花费的时间通常只需3-5天，不仅花费时间短，且费用较低，能量高，精度高，结果稳定性好，覆盖范围广，效率高。
【附图说明】
[0008]图1为微卫星引物在巨魅鱼中的扩增电泳图。
【具体实施方式】
[0009]巨魅鱼微卫星标记开发的方法，方法步骤如下:
(1)剪取巨魅活鱼的肌肉或者肝脏等组织各5克混合，放于干冰寄测序公司或者-80°c冰箱保存；
(2)进行总RNA提取，具体步骤如下:
1)取0.1g步骤(I)的混合组织，在液氮中充分研磨，移入ImL Trizol中，混匀后室温下静置5min，使核蛋白复合物完全解离。样品体积不超过所用Trizol体积的10% ；
2)加入0.2mL氯仿，剧烈摇动或用旋祸震荡器混勾，4°C下12000rpm离心15min ；
3)吸取上清液，重复吸取一次或多次； 4)在吸取的上清液中，每ImLTrizol加入500 μ I的异丙醇，充分混勾后，于室温放置1min ；
5)于40CT 12000rpm离心lOmin，小心倒掉上清液；
6)收集RNA沉淀，用75%的乙醇洗涤两次，重复一次上述步骤5)的离心过程；
7)用一次性使用的吸头吸尽残存的乙醇，将打开管盖的离心管放在实验台上几分钟，使残余的乙醇挥发掉，不要让RNA干透；
8)加入适量RNase-Free的超纯水，将RNA沉淀充分溶解；
(3)用核算测定仪进行RNA纯度检测，以260/280比值来鉴定其质量；
(4)利用TakaraM-MLV反转录试剂盒进行cDNA的合成，步骤如下:
I)取测定浓度的RNA溶液，取含有I μ gRNA的溶液，加入I μ I的浓度为25 μ M的随机引物，加RNase-Free的水补充体积到6 μ ；
2)混合均匀后，将混合液置于70°C加热1min;
3)取出样品，放置在冰上2min，冷却；
4)依次加入2 μ I 的 5 XM-MLV buffer, 0.5 μ I 的 dNTPlOmM 的 dNTP、0.25 μ I 的浓度为40U/ μ I的RNase抑制剂、，200U的M-MLV反转录酶，加水补齐到10 μ 1，混匀；
5)将上述混匀的液体置于30°C加热10min，42°C加热lh，70°C加热15min。；
(5)送测序公司的测序仪进行转录组测序；
(6)进行DNA序列整理，序列表如下:
〈110〉红河学院
〈120〉获得的DNA序列表
<160>1
<210>1
<211>2089
<212>DNA
〈213〉yarrelli)
<220>misc_feature
<400>1
GCGGGTTTAGTTCTCAGGGTCCGTCGGTAGTTTTAAAGACGTTTAGTTAGGAAAAGTTTT 60TATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTATTTTTCTGCAAGCATGGCTCAGGCTCGAGTCAC 120TGATTACTTTGCACAGTCTAAGAGAGCGGGTGTTGAGCGGACTTTGCGATCCAAATCGCA 180GAAATCGAGCGCTGAGGTCCGAGTGGTGTCCACGACCAGGCCTGAGAGGAGCAGCCGCTC 240CACAAACAAACCGCTCCGGGCGGTGCGGGAGGACAGCGAGCGGCTCCGGGCGGTGCAGGA 300GGAGTTCCTCAGGGTGATCGACGAGGCTGTATCCGCTCCTGATCATGCAGAAAGCGGGAC 360AGAGACACGGGGAGTGGAAAAACCCGCTCCGCCAGAGAGTCCCCGAACCCCGAAGAGGAC 420ATCGACTGAGGCGGAGTTTGATGTGTCCTCGGCTGTGGTTAGCTCCACCACGG