一种扩增天津尖丽蚌f型线粒体基因组序列的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，设及基因组序列的扩增方法。 技术背景
[0002] 天津尖丽畔（Aculampro化latientsinensis)隶属于软体动物口、瓣觸纲、畔目、 畔科、尖丽畔属，生活在在泥沙底，水质清净的河流及湖泊的流水环境中，主要集中分布于 我国长江流域中、下游地区，特别是在洞庭湖及都阳湖，W及与其相通的河流内。贝壳呈斜 楠圆形，质厚而坚硬，膨胀；左右两壳微不相等，壳顶位于最前端，向前突出井稍向内弯曲， 背缘、后缘和腹缘相连成一完整的弧形，壳面光滑或具少数不显著凸出的瘤状结节，生长轮 脉粗大，明显，背部有数条不甚明显的斜肋。壳面灰褐色，稍具光泽。较合部发达，左壳具拟 主齿和侧齿各二枚，右壳有拟主齿和侧齿各一枚，拟主齿强大，侧齿上有梳状齿棱，珍珠层 瓷白色。
[0003] 畔类具有很大的经济价值，如培育珍珠，发展我国的珍珠养殖业；提取抗肿瘤成 分；许多贝壳较厚的种类可作为制造纽扣贝雕等工艺品的原料，一些贝壳闪亮的珍珠层可 W用来制造各种精美的螺细、器皿和家具等；畔类软体部分可供人们食用或作为饲料；淡 水畔对水环境中化、化和Cd有去除与积累的作用，吸收富集重金属，改良水质。畔科动物 是淡水贝类最大的一个科，包括674个物种，淡水畔类是淡水生态系统中一类重要的水生 生物，作为滤食者，能够通过滤食营养物质、有机物和浮游生物来改良水质，对水环境还有 生物监测的作用。淡水畔类在淡水生态系统中不可或缺，其生物量和密度往往都在底栖动 物中占优势，对淡水生态系统有重要作用，如果淡水湖泊或者是河流中的淡水畔类消失，将 会引起一系列的生态问题。总而言之，淡水畔类对淡水生态系统至关重要，对水体的水质、 物质循环和能量流动作用巨大，且具有较高的营养、经济和生态价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种快速扩增天津尖丽畔F型线粒体基因组序列的方法。为 了实现上述目的，本发明所解决的技术问题采用W下技术方案来实现。
[0005] 本发明所述方法包括下列步骤：
[0006] (1)提取天津尖丽畔的总DNA;
[0007] (2)利用保守引物分别对coxl、16SrRNA和nadl基因进行普通PCR扩增并测序；
[000引 （3)根据测序结果设计长片段引物进行LA-PCR扩增并测序；
[0009] (4)序列拼接；
[0010] 妨基因注释。
[0011] 所述的长片段引物包括^下立对：
[0012] FTJND1-C0IP1 ；CGCAGAAGGAGAATCAGAACT
[0013] FTJND1-C0IP2；TGCTTAGGTGGATGGACGA
[0014] FTJ16S-NDIP1；AGCATCATAGTGCTGCCTTATA
[0015]FTJ16S-NDIP2；GGATTCCGATGATTCCTAACT
[0016]FTJCOI-16SP1；TACCAACACCCCTTTCCAC
[0017]FTJCOI-16SP2 ;TTTAGTAGCTCATAGCCATTCG。
[0018] 本发明首次公开了天津尖丽畔的线粒体基因组，也是首次公开了一种扩增天津尖 丽畔线粒体基因组序列的方法，可W为畔科的线粒体基因组学研究和种质资源保护提供重 要的基础材料。
[0019] 线粒体基因组DNA是裸露的双链超螺旋共价闭合环状分子，少数为线状分子（如 原生动物草履虫与四膜虫的mtDNA)，是真核细胞的第二遗传信息系统，或称核外基因及其 表达体系。相对于核DNA，mtDNA具有分子量小、多态性高、结构简单、碱基突变率高、母系遗 传、进化速度快等特点，已被广泛应用于生理病理、临床诊断、遗传变异、分子标记、系统进 化等多方面的研究，与线粒体和线粒体基因组相关的研究已成为临床医学、进化生物学、基 因组学、生物信息学等生命科学领域的研究热点和前沿。
[0020] 畔科动物线粒体的遗传不单单是母系遗传，还存在线粒体基因组遗传的一 种特例--双单亲遗传现象值oubly-UniparentalInheritance,DUI)。该种遗传方 式使后代中雌性mtDN只来自母系（female-transmitted,Ftype)，与严格的母系遗 传相似；而雄性的mtDNA来自双亲，在体细胞中存在F型mtDNA,在精巢中存在父系 mtDNA(male-transmitted,Mtype)。
[0021] 本发明的有益效果；通过设计的特异性长片段引物，通过LA-PCR技术对天津尖丽 畔F型线粒体基因组进行扩增，再进行测序、拼接和校正，获得了天津尖丽畔F型线粒体基 因组全序列。本发明获得的天津尖丽畔F型线粒体基因组序列总长1569化P，可从组成和结 构的角度对天津尖丽畔F型线粒体基因组进行分析，可W丰富畔科线粒体基因组信息，为 畔类的系统发育、种质资源保护、可持续和合理地利用奠定重要的分子遗传学理论基础。
【具体实施方式】
[0022] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发 明保护的范围。
[0023] 一种扩增天津尖丽畔F型线粒体基因组序列的方法如下。
[0024] 1、总DNA提取。
[0025] 使用购自天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，提取天 津尖丽畔的总DNA，包括W下步骤：
[0026] (1)剪取天津尖丽畔新鲜闭壳肌组织l〇〇-150mg，置于1. 5ml已灭菌离屯、管中，用 洁净的灭好菌的剪刀充分剪碎放入装有2001GA缓冲液的离屯、管中，祸旋振荡15sec。
[0027] 似加入201proteinaseK(20mg/mU溶液，祸旋混匀，简短离屯、W去除管盖内壁 的水珠。在56°C放置，直至组织完全溶解，简短离屯、W去除管盖内壁的水珠。
[002引 （3)加入2001缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置lOmin，溶液应变清亮，简短离屯、W去除管盖内壁的水珠。
[0029] (4)加入2001无水己醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离屯、W去 除管盖内壁的水珠。
[0030] (5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12000巧m(~13400*g)离屯、30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[00引](6)向吸附柱CB3中加入5001缓冲液GD佑D中已加入无水己醇），12000巧m(~ 13400*g)离屯、30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[00对 （7)向吸附柱CB3中加入6001漂洗液PW(PW中已加入无水己醇），12000巧m(~ 13400*g)离屯、30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
[0033] (8)重复操作步骤7。
[0034] (9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000巧111(~13400*g)离屯、2min，倒掉废液，将 吸附柱CB3置于室温放置数分钟