一种醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的微波辅助共固定化方法【专利说明】-种酵酬还原酶和葡萄糖脱氨酶的微波辅助共固定化方法(-)
技术领域：
[0001]本发明设及一种醒酬还原酶和葡萄糖脱氨酶双酶的微波辅助共固定化方法。(二）【
背景技术：
】[0002]酶作为一种生物催化剂，因其专一性强、催化效率高和作用条件温和等特性，广泛应用于医药、食品、化工等方面。但天然酶稳定性差，除了一些耐高温的酶及少数可W耐受较低抑条件的酶W外，大多数酶在高温、强酸、强碱条件下都容易变性失活；反应结束后酶与产物混合，不能重复利用，产物分离纯化困难；同时，酶的一次性使用，大大提高了生产成本，不利于连续化生产，限制了酶在工业上更广泛的应用。基于上述情况，固定化酶的概念得W提出，近年来，酶的固定化技术得到了不断发展，在综合不同固定化技术的基础上，又出现了酶的共固定化技术，目前，酶的共固定化技术在临床诊断、发酵过程控制及生物传感器制备等方面都发挥着重要作用。[0003]酶的固定化，是指采用物理或化学方法，将酶与水不溶性载体相结合的技术。固定化之后酶既保持了其催化特性，又克服了游离酶的不足之处，具有稳定性增强，可反复或连续使用及易于和产物分离的显著优点。酶的共固定化即将不同来源的几种酶或酶与某一完整细胞同时固定在同一个载体上，不仅使不同酶及细胞的各自优势得到充分发挥，而且将不同酶与细胞的生物催化性能结合起来。酶的固定化方法分为四类；吸附法，包埋法，结合法W及交联法。[0004]醒酬还原酶作为一类NAD(P)H依赖的氧化还原酶，具有广泛的底物特异性，可将脂肪族醒酬、芳香族醒酬、类固醇等很多幾基化合物还原成相应的醇类，在手性药物及药物中间体合成领域发挥着重要作用。利用醒酬还原酶催化4-氯-3-幾基己酸己醋巧t的14-Chloro-3-oxobutanoate,CO邸）不对称还原合成的（R)-或（S)-4-氯-3-哲基了酸己醋巧th}d4-chlo;r〇-3-hy化oxybutanoate,CHBE)，是多种药物活性成分如（R)-4-氯基-3-哲基了酸己醋、L-肉毒碱、大环内醋A和（时-丫-氨基-0-哲基了酸佑AB0B)等合成的关键中间体，具有重要的应用价值。[0005]在醒酬还原酶的催化反应中，都需要辅酶NAD(P)H的参与W提供反应持续进行所需电子。因此，在反应体系中维持一定浓度的NAD(巧H，是保持反应连续进行的关键因素。葡萄糖脱氨酶作为其辅酶再生系统可在将葡萄糖氧化为葡萄糖酸内醋的同时，将NADP+不断转化为NADPH，通过其与醒酬还原酶的协同作用，共同完成CHBE的生物转化过程。采用醒酬还原酶催化CHBE的合成具有高度的化学、区域和对映选择性，与化学工艺相比，具有明显优势，如；避免了有毒有害催化剂的使用，减少了有机溶剂的使用量，反应可在常温下进行等，相对传统化学合成工艺催化剂来说，该酶催化的反应具有很强的绿色环保概念，具有广阔的应用前景。(H)【
发明内容】[0006]目前催化反应使用的酬还原酶多是游离酶或全细胞，虽操作简单，但催化过程中所需辅因子NAD(P)H价格比较昂贵，且酶无法重复利用，生产成本偏高，限制了酶催化方法的大规模工业化应用。[0007]为了克服游离酶稳定性差、不能重复利用等不足，本发明提供了一种简单、快速的醒酬还原酶和葡萄糖脱氨酶双酶的共价固定化方法，对苯二酿作为交联剂通过与酶上的亲核基团（如氨基或哲基）及MCFS-NH2载体上的氨基反应，将酶共价固定化于载体上，最终获得性能改善的共固定化酶。[000引本发明所采用的技术方案是；[0009]本发明提供一种醒酬还原酶和葡萄糖脱氨酶的微波辅助共固定化方法，所述方法包括：[0010](1)将载体与交联剂混合，在25°c、160~18化pm条件下活化1~2h，离心取沉淀用抑7.0的PBS缓冲液（具体为抑7.0、0.1MPB巧洗漆，离屯、，取沉淀重新分散于抑7.0的PBS缓冲液中制成分散液；所述载体为氨基化的二氧化娃介孔泡沫，所述交联剂为对苯二酿；[0011](2)向步骤（1)分散液中加入醒酬还原酶及葡萄糖脱氨酶，混合后在0~10°C，20~45W微波条件下照射1~5min，离屯、，取沉淀用抑7.0的PBS缓冲液洗漆后，得到共固定化酶。[0012]进一步，步骤（1)所述对苯二酿W0.5mM~2.5mM对苯二酿溶液的形式加入，所述对苯二酿溶液所用溶剂为体积浓度50%己醇水溶液，所述对苯二酿溶液体积用量W载体重量计为100~150ml/g。[0013]进一步，步骤（2)所述醒酬还原酶与载体质量比为0.1~0.2:1。[0014]进一步，步骤（2)所述葡萄糖脱氨酶与载体质量比为0.1~0.2:1。[0015]进一步，步骤（2)所述醒酬还原酶是W醒酬还原酶酶液形式加入，所述酶液是指将含醒酬还原酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镶柱分离后的酶液；所述醒酬还原酶基因的核巧酸序列为SEQIDNO.1所示。[0016]进一步，步骤（2)所述葡萄糖脱氨酶是W葡萄糖脱氨酶酶液形式加入，所述酶液是指将含葡萄糖脱氨酶基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体进行超声破碎，破碎混合液经镶柱分离后的酶液；所述葡萄糖脱氨酶基因的核巧酸序列为SEQIDNO.2所示。[0017]进一步，步骤似所述微波条件为；0~8°C，25~40W照射2~4min。[001引进一步，步骤（2)所述醒酬还原酶酶液按如下方法制得；将含SEQIDNO.1所示醒酬还原酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中，37°C过夜培养，获得菌液；按体积浓度1%接种量将菌液转接于含100yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、200rpm振荡培养至0D600达0.6,加入终浓度0.ImM的IPTG，25°C、150巧m诱导表达12~16h，离屯、收集菌体，超声破碎，离屯、收集上清并用镶柱对其进行纯化，得到醒酬还原酶的酶液。[0019]本发明所述含SEQIDNO.1所示醒酬还原酶基因的重组基因工程菌构建方法为：将SEQIDNO.1所述核巧酸序列与载体祀T28a连接，连接产物转化E.coliD册a感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到祀T28a-Lek质粒。然后将重组质粒导入E.coli化2UDE3)，获得重组菌祀T28a-Lek-E.coliBL2UDE3)。[0020]进一步，步骤（2)所述的葡萄糖脱氨酶酶液按如下方法制得：将含SEQIDNO.2所示葡萄糖脱氨酶基因的重组基因工程菌接种于LB液体培养基中，37°C过夜培养，获得菌液；按体积浓度1%接种量将菌液转接于含100yg/mL氨节霉素的LB液体培养基中，37°C培养至0D600达0.6,向培养液中加入终浓度0.ImM的IPTG，25°C、150巧m诱导表达12~16h，离屯、收集菌体，超声破碎，离屯、收集上清并用镶柱进行纯化，得到葡萄糖脱氨酶的酶液。[002U本发明所述含SEQIDNO.2所示葡萄糖脱氨酶基因的重组基因工程菌构建方法为：将SEQIDNO.2所述核巧酸序列与载体祀T2化连接，连接产物转化E.coliD册a感受态细胞，挑单菌落PCR验证获得阳性克隆，利用质粒提取试剂盒得到祀T2化-GDH104质粒。然后将重组质粒导入E.coli化210E3)，获得工程菌祀T2化-GDH104-E.coliBL210)E3)。[0022]本发明所述氨基化的二氧化娃介孔泡沫载体（MCFs-NHs载体），MCFs是一种无机固定化载体，具有统一的介孔直径、表面积大、容积大、热稳定性高且表面极易被功能化等优点。而微波福射因可加快物质传递过程，使反应速度和反应产率大幅提高，在许多合成反应中发挥着重要作用，近年来常被应用于酶的固定化研究中。本发明所述载体的制备方法参考；AWang,MWang,QWang,FChen,FZhang,HLi,ZZeng,TXie.Stableandefficientimmobilizationtechniqueofaldolaseunderconsecutivemicrowaveirradiationatlowtemperature.BioresourTechnol,2011,102(2):469-474.[002引本发明所述LB培养基组成如下；1%化Cl、1%膜蛋白腺、0.5%酵母提取物，溶剂为去离子水，pH7.0。[0024]与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：本发明选用新型载体材料MC当前第1页1 2 3