一种蛋白质分子量标准的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种蛋白质分子量标准的制备方法。
【背景技术】
[0002] 蛋白质分子量标准是蛋白质电泳必须的生化试剂。通常的蛋白质分子量标准是加 热变性好的天然蛋白质混合而成，成分不均一，种类基本有：磷酸酶b，牛血清蛋白，卵清蛋 白，碳酸苷酶，胰蛋白酶抑制剂，溶菌酶，伴清蛋白，肌动蛋白，3-磷酸甘油醛脱氢酶，肌球蛋 白。蛋白质分子量标准的制备首先是获得高纯度的蛋白质，分离纯化蛋白质的程序通常分 为样品前处理、粗分级纯化、细分级纯化三步。上述传统的纯化程序相对复杂，耗时长，对设 备要求较高，材料消耗大等直接导致了蛋白质分离成本居高不下。据了解蛋白质的分离纯 化的成本约占了蛋白质分子量标准成本的60%~70%。如此高额的成本，无论对生产者还 是使用者而言都是不利的。因此，寻找合适的材料，发展新型的分离纯化技术和简化制备工 艺是降低蛋白质分子量标准制备成本的必由之路。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种蛋白质分子量标准的制备方法。
[0004] 本发明的具体技术方案如下：
[0005] -种蛋白质分子量标准的制备方法，以类弹性蛋白多肽ELP[KV8F-20n]作为蛋白 质分子量标准，其中n为整数或小数，且1 <n< 50，其中ELP[KV8F-20]的氨基酸序列如SEQ ID1所示，ELP[KV8F-20n]为上述ELP[KV8F-20]的n次串联序列，该方法包括如下步骤：
[0006] (1)利用递归定向连接方法将不同数量的ELP[KV8F-20]的基因序列串联起来，获 得ELP[KV8F-20]的n倍长度的不同分子量的ELP[KV8F-20n]基因序列；
[0007] (2)将不同分子量的ELP[KV8F-20n]基因序列插入到表达载体pET-22b(+)上，并 导入宿主菌中诱导表达，得不同分子量的ELP[KV8F-20n];
[0008] (3)在一定的盐离子浓度和特定的缓冲溶液条件下，通过控制溶液温度使不同分 子量的ELP[KV8F-20n]发生相变聚集得到相应的蛋白质溶液，再通过离心纯化得到不同分 子量的ELP[KV8F-20n];
[0009] (4)将不同分子量的ELP[KV8F-20n]混合，得非预染型的所述蛋白质分子量标准。 [0010] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤⑷为：将不同分子量的 ELP[KV8F-20n]经染色后，混合，得预染型的所述蛋白质分子量标准。
[0011] 进一步优选的，所述染色所用染料为雷马素系列染料。
[0012] 进一步优选的，所述染色所用染料为雷马素亮蓝R和雷马素亮橘3R。
[0013] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（2)包括：
[0014] a、将步骤（1)制得的不同分子量的ELP[KV8F-20n]基因序列用限制性内切酶Bgll 和pflMI进行双酶切；
[0015] b、将表达载体pET_22b(+)用限制性内切酶Sfil单酶切；
[0016]c、通过T4DNA连接酶将步骤a和步骤b制得的序列连接起来，获得重组表达载体 pET-22b-ELP[KV8F-20n]；
[0017]d、将上述重组表达载体pET-22b-ELP[KV8F-20n]转入宿主菌中，得到一系列表达 不同分子量的ELP[KV8F-20n]的菌种；
[0018]e、将步骤d获得的菌种进行诱导表达。
[0019] 进一步优选的，所述宿主菌为大肠杆菌BL21 (DE3)或BLR。
[0020] 在本发明的一个优选实施方案中，所述ELP[KV8F-20]的核苷酸序列如SEQID2所 不〇
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 1、本发明的方法利用类弹性蛋白多肽的特有的温度敏感性，通过简单的离心即可 得到高纯度的蛋白质，从而制备出蛋白质分子量标准，本发明操作简单，设备要求低，易工 业化规模生产。
[0023]2、本发明的方法制备的蛋白质分子量标准成分均一、性状稳定、成本低廉。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例通过RDL法构建质粒的示意图；
[0025] 图2为本发明实施例制备的非预染型蛋白质分子量标准电泳图。图中，M:Thermo FisherScientific公司的蛋白质分子量标准；泳道1:非预染性类弹性蛋白质分子量标 准。
[0026] 图3为本发明实施例制备的预染型蛋白质分子量标准电泳图。图中，M:Thermo FisherScientific公司的蛋白质分子量标准；泳道1~5 :预染的ELP[KV8F_20]、 ELP[KV8F-40]、ELP[KV8F-80]、ELP[KV8F-120]、ELP[KV8F-140];泳道 6:预染性类弹性蛋白 质分子量标准。
[0027]图4为本发明实施例制备的预染型蛋白质分子量标准的稳定性电泳检测图。图 中，M:ThermoFisherScientific公司的蛋白质分子量标准；泳道1 : - 20°C储藏180天后 的预染性类弹性蛋白质分子量标准。
【具体实施方式】
[0028] 以下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0029]类弹性蛋白多肽（Elastin-likepolypeptides,ELPs)是一类具有特殊性质的人 造蛋白质，即温度敏感型人造蛋白。其基本单位是一个Val-Pro-Gly-Xaa-Gly五肽序列单 元，其中Xaa是除脯氨酸以外的任意氨基酸。不同数量的五肽序列单元串联而构成长度各 异的ELPs。因此，通过控制五肽单元的重复数目即可实现对ELPs分子量大小的控制。ELPs 对温度的敏感性表现在：当环境温度低于某个温度时，蛋白质是可溶状态；而环境温度高 于某个温度时，蛋白质是不可溶状态。这种性质称之为ELPs的可逆相变。利用ELPs的这 一种特殊性质，仅通过控制环境温度就可对其分离纯化，并且获得高纯度的ELPs。利用温度 分离纯化蛋白操作简便，耗时短，效率高，可有效降低蛋白质的生产成本，同时容易实现工 业化生产。
[0030] 实施例1
[0031] -种蛋白质分子量标准的制备方法，以类弹性蛋白多肽ELP[KV8F-20n]作为蛋白 质分子量标准，其中n为整数或小数，且1 <n< 50,其中ELP[KV8F-20]的氨基酸序列如 SEQID1所示，其核苷酸序列如SEQID2所示，ELP[KV8F-20n]为上述ELP[KV8F-20]的 n次串联序列，也就是说ELP[KV8F-20]分子量为9kD，蛋白质分子量标准：ELP[KV8F-20]、 ELP[KV8F-40]、ELP[KV8F-80]、ELP[KV8F-120]、ELP[KV8F-140]，按照 10kDa或者 20kDa的间 隔梯度递增。
[0032] 该方法包括如下步骤：
[0033] (1)利用递归定向连接方法（recursivedirectionalligation，RDL，Meyer DE，ChilkotiA.Geneticallyencodedsynthesisofprotein-basedpolymerswith preciselyspecifiedmolecularweightandsequencebyrecursivectional ligation:examplesfromtheelastin-likepolypeptidesystem[J].Biomacromole cules，2002, 3 (2) : 357 - 367.)连接不同数量的ELP[KV8F-20]的基因序列串联起来，获 得ELP[KV8F-20]整数倍长度的不同分子量的ELP[KV8F-20n]基因序列：如图1所示， 首先通过限制性内切酶BglI、pf1MI双酶切已构建好的克隆载体pUC19-ELP[KV8F-20] (含有该克隆载体的菌种为CN102127156A公开，为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，保 藏号为CGMCCNO. 4185,保藏日期：2010年9月17日，保存于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研 宄所），获得ELP[KV8F-20]基因片段。接着，将ELP[KV8F-20]基因片段连接到克隆载体 pUC19