一种磁微粒化学发光试剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本公开属于免疫技术检测领域，尤其设及一种磁微粒化学发光试剂盒的制备方 法，W及采用此方法制备的试剂盒；本公开还设及一种检测人血清中肌红蛋白的定量试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 肌红蛋白是一种存在于屯、肌和骨骼肌细胞质的蛋白质，分子量为17. 8kD。
[0003] 在肌细胞受损后，肌红蛋白快速释放到循环系统中。测定血清中的肌红蛋白是诊 断急性屯、肌梗塞（AMI)、再梗塞W及溶栓治疗后成功再灌入诊断的重要指标之一。浓度在症 状出现后约两个小时肌红蛋白浓度升高，因此可作为诊断屯、肌梗塞的早期指标。根据不同 的再灌入治疗措施，在梗塞形成开始之后，血液循环中的肌红蛋白浓度在梗塞发生后4到 12小时可达到高峰，约24小时之后下降至正常水平。骨骼肌受损后W及肾功能严重障碍也 可导致肌红蛋白浓度升高。
[0004] 在没有骨骼肌损伤的情况下，肌红蛋白用作屯、肌梗塞病症的早期标志。肌红蛋白 的阴性预测结果是99%，用来排除非屯、肌梗塞患者。当结合其他屯、脏标志物（如CK-MB或 肌巧蛋白I) 一起应用时，肌红蛋白具有卓越的诊断价值，可用于评估潜在的急性屯、肌梗塞 患者。
[0005] 目前临床上采用的肌红蛋白检测手段包括：ELISA法和免疫比浊法。然而，运些方 法的缺点在于灵敏度不够高，检测用时长，线性范围不够宽，样本不得不进行稀释处理。
[0006] 鉴于上述不足之处，人们开发了一种新的检测方法，其结合了磁分离技术和化学 发光技术的双重优势，例如中国专利CN102435752B中公开了 一种肌红蛋白定量测定试剂 盒及其检测方法，该试剂盒包含标记有抗肌红蛋白单克隆抗体的磁性微球、和碱性憐酸酶 标记的抗肌红蛋白单克隆抗体。改方法将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，从而提供了 一种接近均相的反应体系，具有较高的检测灵敏度和特异性。然而，现有技术中抗体包被磁 微粒的方法是先将磁微粒和抗体混合均匀后加入交联剂（如邸C)。即便在CN102435752B 中，也是将抗体和交联剂辛二酸二班巧酷亚胺醋进行事先混合。在运些包被方法中，交联剂 会损害抗体的活性。并且，试剂线性范围不够宽广，高值样本需要事先进行稀释处理。鉴于 此，本领域的技术人员非常希望获得一种新型的磁微粒包被方法W便改善上述技术中的缺 陷。
【发明内容】
[0007] 根据本申请的一方面，提供一种磁微粒的包被方法，其包括步骤：
[0008] a)将磁微粒和结合缓冲液进行接触，获得第一混合物；
[0009] b)将碳二亚胺和第一混合物在20°C至30°C接触lOmin至比，获得第二混合物；W 及
[0010] C)将单克隆抗体和第二混合物在20°C至30°C避光反应化至地，得到包被有单克 隆抗体的磁微粒。 阳0川根据一些实施方式，所述结合缓冲液的抑为4. 5至6.0 ;优选地，抑选自：4. 5、 4. 8、5. 0、5. 2、5. 5、W及上述任意两个数值之间的范围。在更优选的实施方式中，所述结合 缓冲液的抑为5.0。在具体的实施方式中，所述结合缓冲液是MES缓冲液。在更优选的实 施方式中，结合缓冲液是抑为5. 0的0. 1MMES缓冲液。
[0012] 根据一些实施方式，所述磁微粒的粒径为1μπι至3μπι。在优选的实施方式中，所 述磁微粒的粒径为0. 8至1. 2μm。技术人员理解，本公开方法中所用的磁微粒实际上不可 能是单个的磁微粒，而是众多磁微粒。因此，磁微粒的粒径在统计学意义上是个粒径范围的 分布。例如，当提及粒径为1μm的磁微粒时，并不意味着每一个单个的磁微粒的粒径刚好 是1μm，而是允许在1μm附近（例如± 10%的误差）的范围之内。鉴于此，在本申请的上 下文中，W粒径的范围来表示磁微粒的粒径。
[0013] 根据一些实施方式，在步骤b)中将碳二亚胺和第一混合物在20°C至30°C接触 20min至40min，获得第二混合物。在优选的实施方式中，步骤b)中将碳二亚胺和第一混合 物在22°C至28°C混匀25min至35min。在具体的实施方式中，碳二亚胺的浓度为8mg/ml至 15m邑/ml,1?? 10m邑/ml。
[0014] 根据一些实施方式，步骤c)中将单克隆抗体和第二混合物在22°C至28°C避光反 应3h。在具体的实施方式中，单克隆抗体是肌红蛋白单克隆抗体。然而技术人员理解，尽管 本申请的具体实例中采用了特定的单克隆抗体，但是任何其它类型的抗体同样适用于本申 请。因为，本申请的方法设及的是一种改善的磁微粒包被步骤和封闭步骤，只要抗体可W结 合至磁微粒即可，不受限于抗体的特定结构（如CDR的序列）。
[0015] 根据一些实施方式，本申请的磁微粒的包被方法还包括步骤d):向所述包被有单 克隆抗体的磁微粒中加入Biolipi化re,在22至28°C进行2至化封闭反应；之后在37°C 反应15min至60min。任选地，本申请的磁微粒的包被方法还包括步骤e):终止步骤d)中 的封闭反应。任选地，本申请的磁微粒的包被方法还包括步骤f):离屯、并收集包被有单克 隆抗体的磁微粒。Biolipidum狡;是一种具有憐脂极性基团2-甲基丙締酷憐酸胆碱（MPC) 的聚合物化Ishihara等人J.Biomed.Mater.Res.，39, 323,1"8 年）。BioHpidure巧包 括但不限于Biolipidure-103、Biolipidure-203、Biolipidure-206、Biolipidure-405、 Biolipidure-502、Biolipidure-702、Biolipidure-802、Biolipidure-1002、 Biolipidure-1201 和Biolipidure-1301。在本申请的上下文中，任何和Biolipidure巧 等同的产品同样可W用于本申请的方法。在具体的实施方式中，所述BioHpidure?；^Biolipidure-502或Biolipidure-1002 ;优选Biolipidure-1002。
[0016] 根据一些优选的实施方式，在步骤d)中，向所述包被有单克隆抗体的磁微粒中 加入Biolipidure，在22至28°C进行2至化封闭反应，之后在37°C反应15min、30min或 60min，最优选反应30min。
[0017] 根据一些具体的实施方式，通过加入泽灭缓冲液在22至28°C避光反应0.5至 1.化来终止封闭反应。本领域公知的泽灭缓冲液都可W使用。例如，在具体的实施方式中， 泽灭缓冲液包含lOmMPBS、Ig/lOOmlBSA、40mM甘氨酸，pH为7. 4。
[0018] 根据一个具体的实施方式，磁微粒的包被方法包括步骤：
[0019] a)将2μm磁微粒和抑5. 0的0.IMMES缓冲液进行接触，获得第一混合物；
[0020] b)将lOmg/ml碳二亚胺和第一混合物在20°C至30°C接触30min，获得第二混合 物；
[0021] C)将单克隆抗体和第二混合物在20°C至30°C避光反应化，得到包被有单克隆抗 体的磁微粒；
[0022] d)向所述包被有单克隆抗体的磁微粒中加入Biolipi化re-1002,在22至28°C进 行化封闭反应，之后在37°C反应30min;
[0023] e)加入泽灭缓冲液在20°C至30°C避光反应比W便终止所述封闭反应，所述泽灭 缓冲液包含lOmMPBS、Ig/lOOmlBSA、40mM甘氨酸，pH为 7. 4 ;
[0024]f)离屯、并收集包被有单克隆抗体的磁微粒。
[00巧]根据本申请的另一方面，提供了一种包被有单克隆抗体的磁微粒，其是通过本申 请的方法制备得到的。
[00%] 根据本申请的另一方面，还提供了通过本申请的方法制备得到的包被有单克隆抗 体的磁微粒在制备检测试剂中的用途。
[0027] 根据本申请的另一方面，还提供了一种检测试剂，其包含本申请的包被有单克隆 抗体的磁微粒。
[0028] 根据本申请的另一方面，还提供了一种肌红蛋白检测试剂盒，其包含或者由如下 组成：磁分离试剂R1，标记试剂R2,和底物溶液。在【具体实施方式】中，磁分离试剂R1包含 包被有肌红蛋白单克隆抗体的磁微粒。在R1中，包被有肌红蛋白单克隆抗体的磁微粒允 许置于适当的缓冲液中。R1的缓冲液优选包含：〇. 6g/100ml化C1、0. 2g/100ml吐溫20、 0. 2g/100mlNaN3、50mMTris-HCl缓冲液，pH7. 6