用于测定酶活性的电化学发光(ecl)检测试剂和相关方法
【专利说明】用于测定酶活性的电化学发光（ECL)检测试剂和相关方法
[0001] 优先权
[0002] 本申请要求2013年2月25日提交的美国临时专利申请系列号61/769, 044和2013 年6月28日提交的美国临时专利申请系列号61/840, 820的权益，通过参考将其每一个的 全部内容并入本文。
技术领域
[0003] 本公开内容大体上涉及开发用于检测和定量测定生物样品中的酶的检测试剂和 基于电化学发光（ECL)的检验以及试剂测试试剂盒。具体而言，本公开内容涉及使用具有 电化学发光官能团的含二硫基的检测试剂（disulfide-containing detection reagent) 检测和测定样品中的酶活性的方法。
【背景技术】
[0004] 血液或血浆中的酶活性的测定可以是显示疾病状况和风险因子的有用检测和预 测工具。可以在临床环境中进行的血液和血浆酶活性检验可用于快速确定哪些患者会接受 例如抑制剂（在病理学酶过度活跃的情况下），或者它们可用作组织损伤、疾病病理的诊断 指标，或者用于检测毒性酶抑制剂的存在。
[0005] 存在标准临床化学检验以测定临床相关酶活性或酶抑制剂的存在。这些检验中 的一些可以通过改变反应混合物中NADPH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的还原形式）或 NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原形式）的量而测定靶向酶活性，无论直接进行还是通 过另外的反应混合物酶和底物进行，所述另外的反应混合物酶和底物将靶向酶的活性测定 值与NADH或NADPH的变化关联起来。目前，这些检验使用颜色变化或其它已知的检测方法 来获得其定量检测读数。然而，需要能够对临床化学酶活性进行电化学发光（ECL)测定的 检测试剂和方法，通过将检测试剂二硫键的切割与例如NADPH、NADH或游离巯基的变化关 联起来，所述检测试剂和方法能够用于提供酶活性的所需定量检测读数。
【发明内容】
[0006] 本公开内容大体上涉及一种检测试剂，其包含具有可切割二硫键的分子，该分子 具有在所述二硫键的第一侧的具电化学发光（ECL)活性的钌螯合物，和在所述二硫键的第 二侧的固定性部分（immobilizing moiety)。
[0007] 在一些实施方式中，本公开内容涉及一种检测试剂，其中，所述检测试剂的二硫键 能够被游离巯基切割。
[0008] 本公开内容大体上涉及检测试剂的制备方法，所述方法包括：对具有可切割二硫 键的分子，在所述二硫键的第一侧附接具电化学发光（ECL)活性的钌螯合物，在所述二硫 键的第二侧附接固定性部分。
[0009] 本公开内容大体上涉及检测试剂的制备方法，所述方法包括：在第一分子和第二 分子之间形成可切割二硫键；对所述第一分子附接电化学发光官能团；和对所述第二分子 附接固定性部分。
[0010] 在一些实施方式中，本公开内容涉及检测试剂的制备方法，其中，所述检测试剂的 二硫键能够被游离巯基切割。
[0011] 本公开内容大体上涉及测定样品中产生的NADPH的方法，所述方法包括：将具有 二硫键的检测试剂、所述样品和NADPH催化的二硫化物还原酶组合来形成反应混合物，其 中在NADPH的存在下所述检测试剂的二硫键被所述还原酶切割，其中所述检测试剂含有在 所述二硫键的第一侧的具ECL活性的钌螯合物和在所述二硫键的第二侧的固定性部分， 其中所述切割产生具有所述具ECL活性的钌螯合物的第一切割产物和具有所述固定性部 分的第二切割产物，且其中所述还原酶进行的切割与在所述样品中产生的NADPH的量成 比例；并且测定ECL信号的不存在、存在或振幅（amplitude)，其中，ECL信号的不存在或 量级减少表明在所述样品中存在NADPH，并且其中最大ECL信号表明在所述样品中不存在 NADPH0
[0012] 在一些实施方式中，本公开内容大体上涉及测定样品中产生的NADPH的方法，其 中，产NADPH酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
[0013] 在一些实施方式中，本公开内容大体上涉及测定样品中产生的NADPH的方法，其 中，切割二硫化物的还原酶选自谷胱甘肽还原酶和锥虫胱甘肽还原酶。
[0014] 本公开内容大体上涉及测定样品中产NADPH酶的活性的方法，所述方法包括：(a) 将所述样品、NADP+、和对所述样品内的待测定酶特异的底物组合，以在从产生NADPH的条 件下形成反应混合物；(b)将步骤（a)的所述反应混合物与谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽二 硫化物在将谷胱甘肽二硫化物还原成还原形谷胱甘肽的条件下组合；（c)将步骤（b)的所 述反应混合物与含二硫基的检测试剂组合，所述检测试剂具有在所述二硫键的第一侧的具 ECL活性的钌螯合物和在所述二硫键的第二侧的固定性部分，其中所述含二硫基的检测试 剂由还原型谷胱甘肽非酶促地切割，其中由还原型谷胱甘肽进行的切割与在所述样品中产 生的NADPH的量成比例；和（d)测定ECL信号的不存在、存在或振幅，其中ECL信号的不存 在或量级减少表明在所述样品中存在产NADPH酶，并且其中最大ECL信号表明在所述样品 中不存在产NADPH酶。
[0015] 在一些实施方式中，本公开内容大体上涉及测定样品中产NADPH酶的活性的方 法，其中，步骤（a)在适于特定反应的规定温度下以规定时间进行。
[0016] 在一些实施方式中，本公开内容大体上涉及测定样品中产NADPH酶的活性的方 法，其中，所述二硫化物可切割还原酶选自谷胱甘肽还原酶和锥虫胱甘肽还原酶。
[0017] 在一些实施方式中，本公开内容大体上涉及测定样品中产NADPH酶的活性的方 法，其中，产NADPH酶是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
[0018] 本公开内容大体上涉及测定样品中酯酶活性的方法，所述方法包括：在下述条件 下将反应混合物组合，其包括含有酯酶的所述样品、酯酶底物的硫酯类似物和含二硫基的 检测试剂，所述含二硫基的检测试剂具有在所述二硫键的第一侧的具ECL活性的钌螯合物 和在所述二硫键的第二侧的固定性部分，所述条件是使得所述底物的硫酯类似物被所述反 应混合物中的酯酶脱酰基化，从而产生激活的底物类似物，所述激活的底物类似物具有暴 露的脱酰基化游离巯基，所述脱酰基化游离巯基切割所述含二硫基的检测试剂的二硫键， 产生的可检测ECL信号的变化与所述反应混合物中的酯酶活性成比例；和测定ECL信号。
[0019] 在一些实施方式中，本公开内容大体上涉及测定样品中酯酶活性的方法，其中，所 述酯酶是Lp-PLA2 (血小板激活因子乙酰水解酶）。
[0020] 在一些实施方式中，本公开内容大体上涉及测定样品中酯酶活性的方法，其中，底 物的硫酯类似物选自硫代-血小板激活因子（PAF)、溶血-硫代-PAF(lys〇-thi〇-PAF)、硫 代乙酰胆碱、硫代丙酰胆碱和硫代丁酰胆碱。
[0021] 在一些实施方式中，本公开内容大体上涉及测定样品中酯酶活性的方法，其中，所 述固定性部分是生物素。
[0022] 在一些实施方式中，本公开内容大体上涉及测定样品中酯酶活性的方法，其中，所 述组合步骤进一步包括组合洗涤剂。
[0023] 在一些实施方式中，本公开内容大体上涉及测定样品中酯酶活性的方法， 其中，所述洗涤剂选自CHAPS((胆酰胺丙基）二甲氨基]-1-丙磺酸盐）和Triton? X-100 (4-(1，1，3, 3-四甲基丁基）苯基-聚乙二醇、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇 叔辛基苯基醚）。
[0024] 在一些实施方式中，本公开内容大体上涉及测定样品中酯酶活性的方法，其中，所 述方法还包括在组合步骤之后且在测定步骤之前调整pH的步骤。
[0025] 本公开内容大体上涉及用于执行本文所述方法的试剂盒。在一些实施方式中，所 述试剂盒可以包括：含二硫基的检测试剂；酯酶底物的硫酯类似物；和用于执行酯酶活性 测定检验的说明书，所述酯酶活性测定检验包括下述步骤：以在下述条件下将反应混合物 组合，所述反应混合物包括含有酯酶的所述样品、酯酶底物的硫酯类似物和含二硫基的检 测试剂，所述含二硫基的检测试剂具有在所述二硫键的第一侧的具ECL活性的钌螯合物和 在所述二硫键的第二侧的固定性部分，所述条件是使得所述底物的硫酯类似物被所述反应 混合物中的酯酶脱酰基化，从而产生激活的底物类似物，所述激活的底物类似物具有暴露 的脱醜基化游尚疏基，所述脱醜基化游尚疏基切割所述含^硫基的检测试剂的^硫键，广 生的可检测ECL信号的变化与所述反应混合物中的酯酶活性成比例；和测定ECL信号。
【附图说明】
[0026] 本说明书中包含所附表和图，其构成本说明书的一部分。
[0027] 图IA是使用二硫硝基苯甲酸（DTNB)作为底物的比色检验的示意性图示。
[0028] 图IB是使用谷胱甘肽二硫化物（GssG)作为检测试剂的ECL检验的示意性图示。
[0029] 图2是从实施例7描述的二硫化物反应收集的数据的图形图示，其显示GssG切割 (% )v. s.酶浓度（ng/mL)。
【具体实施方式】
[0030] 检测试剂
[0031] 本公开内容提供一种检测试剂，其用于检测和测定酶活性的检验和方法。该检测 试剂允许在标准的基于电化学发光（ECL)的检验中测定酶活性，并且可用于检验组（assay panel)和用于即时仪器上。所述检测试剂可以是具有可切割二硫键或一S- S-的二硫化 学基团的分子或化合物。在一些实施方式中，检测试剂可以具有在二硫键的第一侧上的至 少一种电化学发光官能团，例如具电化学发光（ECL)活性的钌螯合物。在一些实施方式中， 检测试剂可以具有在二硫键的第二侧上的固定性部分。
[0032] 在一些实施方式中，检测试剂的二硫键能够被通过反应混合物中的组分的反应而 暴露出的游离巯基切割。反应混合物中的组分可以包括诸如酶、底物或代谢物等至少一种 未知被分析物、检测试剂、缓冲液和检验试剂，以及诸如血液、血浆、血清、红细胞裂解物、唾 液、尿和组织提取物等生物样品。当将反应混合物的组分混合时，在一些实施方式中可以创 建条件，该条件使得酶独立地或与反应混合物中的其它组分联合起作用，并最终暴露游离 巯基。然后游离巯基可以切割具有电化学发光官能团的检测试剂的二硫键。在一些实施方 式中，检测试剂能够与样品和/或反应混合物中存在的酶的量成比例地被切割。
[0033] 电化学发光官能团可以充当检测标记或标签，其可以在ECL反应室（如在流式细 胞仪中的ECL反应）内或在一次性电极上被检测或定量。固定性部分可以用于在检测过程 中将检测试剂保持在ECL反应室中的ECL电极附近。因此，例如，当检测试剂的二硫键被 切割时，电化学发光官能团可以从固定性部分脱离，并因此当其可以在检验洗涤步骤中被 冲洗掉时变为不能被检测。这于是可减少通过对ECL反应室中的ECL激活电极施加电压 而产生的ECL信号。电化学发光官能团和固定性部分都可以直接连接在二硫键上或通过连 接中间体而间接