一种检测克伦特罗的化学发光免疫分析试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫检测分析技术领域，涉及检测动物组织、尿液、饲料等样本中克伦 特罗含量的化学发光免疫分析试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 克伦特罗（Clenbuterol,CLE)是一种目2-肾上腺素兴奋剂，其化学性质稳定，易 被机体吸收，能持久引起交感神经兴奋，并使脂肪激酶活化，减缓或减少脂肪沉积，增加肌 肉组织沉积，使营养重新分配，从而改善肉畜禍体品质，提高瘦肉率，但该药物在体内排泄 速率慢，易蓄积在动物内脏、脂肪等组织中，人食用含有该药物残留的动物产品后易引起中 毒，对肝、肾等内脏器官产生毒害，同时出现必棒、头痛、目眩、恶必、呕吐、必率加快、肌肉振 颤等症状，严重者甚至死亡，研究表明如果长期食用，还可导致染色体崎变，诱发恶性肿瘤。 因此，发明一种灵敏度高，操作简便，费用较低的分析方法和试剂，对于国内食品安全是很 有意义的。
[0003]化学发光免疫检测技术是上世纪80年代继酶联免疫技术和放免技术之后发展起 来的新兴技术，相对于后两者化学发光免疫技术具有高灵敏度、高特异性、操作简便、快速、 标记结合物稳定，同时无放射性同位素损伤和污染等特点，因此近年来在免疫检测分析中 被广泛推广使用。
【发明内容】
[0004]本发明需要解决的技术问题在于提供一种克伦特罗定量检测试剂盒及其检测方 法，采用该试剂盒进行克伦特罗检测具有较高的灵敏度和特异性，操作简便、检测时间更 短。
[0005]本发明提供了克伦特罗化学发光免疫分析试剂盒，该试剂盒包括；磁微粒试剂、克 伦特罗标准品、克伦特罗抗体、清洗浓缩液、发光底物溶液和样本稀释液。
[0006]所述的磁微粒试剂为连接克伦特罗完全抗原的磁微粒溶液； 所述的标准品为含有已知浓度克伦特罗抗原的缓冲液； 所述的克伦特罗抗体为碱性磯酸酶标记的克伦特罗单克隆抗体； 所述的清洗浓缩液是含有Tris和表面活性剂的缓冲液； 所述的发光底物溶液是含有AI^发光液的缓冲液； 本发明提供检测克伦特罗的样品前处理方法，具体如下： 尿样：取待测尿样离必，500化pm, 10分钟，取50μ1上清液体待测。最终检测结果乘W稀释倍数1。
[0007] 组织样品：取1.Og粉碎的样品与4. 0ml己腊和1. 0ml己酸己醋混合均匀；强力振 荡3分钟；500化pm离必10分钟；取1ml上清液，6(TC氮气吹干；加入1ml样品稀释液，混 匀，再加入1ml正己焼，混匀；500化pm离必10分钟；取50μ1下层液体待测。最终检测结 果乘W稀释倍数5。
[000引饲料样本：取1.Og粉碎的样品与5.ο血己腊混合均匀；强力振荡3分钟； 5000巧m离必10分钟；取1.OmL上清液，60°C氮气吹干；加入1ml样品稀释液，混匀，再 加入1ml正己焼，混匀；500化pm离必10分钟；取50ul下层液体待测。
[0009] 最终检测结果乘W稀释倍数5。
[0010] 本发明的检测方法如下： 1)取多支平底试管，在每一平底试管中加入50μL克伦特罗标准品、30μL磁微粒试 剂、50μL克伦特罗抗体，充分混匀，37°C温育15分钟。
[0011] 2)将平底试管在磁分离器上静置2分钟，然后倾倒上清液，将试管及磁分离器一 同倒置在吸水纸上拍干；每管中加入300μL清洗液，混匀后，将平底试管在磁分离器上静 置2分钟，然后倾倒上清液，将试管和磁分离一同倒置在吸水纸上拍干；重复2次。
[0012] 3)每个平底试管中加入100μL发光底物溶液，在化学发光仪上测定每管的发光 值。
[0013] 4)据测定的发光值和对应的克伦特罗标准品浓度，绘制标准曲线。
[0014] 5)在平底试管中，加入50μL克伦特罗待测样本、30μL磁微粒试剂、50μL克伦特 罗抗体，充分混匀，37°C温育15分钟。
[0015]6)重复步骤（2)和（3)的操作，然后根据标准曲线得到待测样品中测克伦特罗浓 度。
[0016] 本发明具有W下优点： 1、使用磁珠为固相替代酶标板，反应更充分和迅速，缩短了反应时间，降低了非特异吸 附。
[0017]2、使用碱性磯酸酶标记单克隆抗体，稳定性和亲和力更高，提高了试剂盒性能。
[0018] 3、使用化学发光底物溶液，使检测的灵敏度得到了提高，而且线性范围更宽。
[0019] 4、本方法的建立可W为其他试剂盒的开发提供一种方便、高灵敏度、准确性和稳 定性的免疫检测方法。
[0020] 本发明的主要创新之处在于： 1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，与酶联免疫技术相比，本发明 试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。
[0021] 2、试剂盒中磁微粒试剂、酶标抗体、标准品、发光底物溶液及样本稀释液均是直接 使用液，试剂盒使用更方便。
[0022] 3、本发明的检测克伦特罗的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒主要采用竞争法定 量检测动物尿液、组织及饲料样品中克伦特罗的含量；能快速、高通量检测大批样品，采用 了高特异的单克隆抗体和超顺磁、高分散、比表面积大的磁微粒子，主要试剂W工作液的形 式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明 的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利，与市场上的 酶联免疫试剂盒等相比，线性范围宽，适用于大批量样品筛选的定量。
【附图说明】
[0023]图1为本发明的克伦特罗化学发光免疫检测标准曲线，其中，横坐标为克伦特罗 的浓度，纵坐标为相对发光强度。
【具体实施方式】[0024]实施例1 一、磁珠缓冲液配制操作规程，W配制1L为例： 1、 根据配制量，选择合适容器，加入0.化g700mL超纯水； 2、 称取化is6. 02g，Nar^ 0. 99g于容器中，混匀，室温揽拌2小时； 3、 检测溶液抑，应在10左右； 4、 调节抑值为8.0 ; 5、 量取Tween-20 2. 76血；称取硫酸新霉素0.99g;四环素0.03g;BSA4.97g于容器 中，揽拌1小时，调抑值至8. 0 + 0. 05 ; 6、 定容至1L,调抑值至8. 0 + 0. 05 ; 7、 用0.22μm滤膜过滤，4°C保存。
[00巧]二、磁微粒试剂的制备过程 将直径为0.lum的四氧化Η铁磁性微球用邸C进行活化，室温振荡15分钟，用 0.Olmol/LρΗ7. 4PBS缓冲液清洗Η次后重悬，使磁性微球浓度为50-100mg/mL;然后，每毫 升悬液中加入克伦特罗完全抗原500μg，37°C混匀温育3-6小时；用0.Olmol/LpH7. 4PBS 缓冲液清洗Η次，用1%BSA0.Olmol/LpH7. 4的PBS缓冲液于37°C封闭1. 5小时；最后用 0. 05mol/LP册.0化is-HCl或PBS缓冲液清洗Η次，并用上述磁珠缓冲液配制成一定浓度 的工作液。
[0026] 实施例2碱性磯酸酶ΑΡ与克伦特罗完全抗体的偶联 使用SMCC活化剂对碱