专利名称：克伦特罗单克隆抗体的制备及其应用的制作方法
克伦特罗单克隆抗体的制备及其应用技术领域
本发明属于生物化学分析技术领域，具体涉及一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法以及用途，用于检测克伦特罗的酶联免疫检测试剂盒和胶体金试纸卡，其特别·适用于畜禽组织、尿样、饲料、乳制品等样品中克伦特罗药物残留的检测。技术背景
克仑特罗(Clenbuterol，CBL)，学名盐酸克仑特罗，又名双氯胺、氯哮素、克喘宁。 克仑特罗是一种β -兴奋剂，20世纪80年代初，美国一家公司开始将其添加到饲料中，增加瘦肉率。猪食用后能提高生长速度，在代谢过程中促进蛋白质合成，加速脂肪的转化和分解，提高了猪肉的瘦肉率，因此称为瘦肉精；它还使猪毛色红润光亮，收腹，卖相好；屠宰后，肉色鲜红，脂肪层极薄，往往是皮贴着瘦肉，瘦肉丰满。但是肥猪饲喂瘦肉精后，会发生四肢震颤无力、心肌肥大、心力衰竭等毒副作用。人如果摄入量过大或无病摄入该药，就可能出现副作用或中毒事故，表现为心动过速、肌肉震颤、心悸、恶心呕吐、头晕、神经过敏和外周血管扩张等，特别对高血压、心脏病、甲亢、前列腺肥大等疾病患者以及妊娠早期和分娩前期妇女危险更大。故我国和其他许多国家现已禁止在饲料中添加使用克伦特罗，《农业部关于下达2011年兽药监督抽查计划的通知》(农医发[2011] I号文件)要求对生产、经营、使用环节中的肉制品进行严格的监测抽检、跟踪抽检和定向抽检。
目前分析检测克伦特罗的方法主要有仪器检测法和免疫分析方法，其中仪器检测方法主要涉及高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)，但是仪器检测方法所用的仪器几乎都属于大型仪器，价格昂贵，样品前处理过程复杂，需要专业技术人员才可操作仪器，检测过程耗时长，检测成本高，不适合现场监控和大量样品的筛查；免疫分析方法主要包括酶联免疫吸附检测方法(ELISA)和免疫胶体金检测方法，这两种方法均属于快速检测方法，并在食品安全监管的现场大量样品筛查工作中已经被使用。两种检测方法均操作简单快速、不需大型仪器设备、不需专业技术人员操作即可完成检测，特别适合于现场大批量样品抽检。但是，目前的检测克伦特罗酶联免疫检测试剂盒对检测克伦特罗特异性不理想，试剂盒的灵敏度不高，稳定性不好，样品前处理方法繁琐费时、样品前处理所用到的试剂大多数为有机试剂，对人体和环境有一定的危害；克伦特罗胶体金试纸卡存在着检测产品稳定性差，检测结果不够准确的缺点。本发明为了解决上述问题，从改造克伦特罗半抗原结构出发，进而优化免疫原和包被原结构，来改善抗体的质量，提高抗体的特异性，增强抗体与抗原的识别能力。发明内容
本发明的一个目的是针对现有克伦特罗检测技术的不足，提供了一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法，使其具有抗体效价高、特异性强、成本低廉的特点。
本发明的克伦特罗单克隆抗体是通过以下技术方案得以实现的
1、克伦特罗抗原的制备
(I)、本发明中的克伦特罗半抗原合成步骤为
a)1. 0-10. Og盐酸克伦特罗加入到20_100ml 二甲基甲酰胺(DMF)中，加入5_25ml 三乙胺，10-20%摩尔当量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，0°C下滴加1. 1_1.5摩尔当量的叔丁基二甲基氯硅烷在10-50ml DMF中的溶液，滴加完毕后，室温继续反应1_10小时，蒸除大部分溶剂，加水，乙酸乙酯萃取，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷-乙酸乙酯中重结晶得到白色固体，为O-硅烷化克伦特罗；(合成路线如
图1a)
b) 11. 0-5. Og 步骤(I)所得产物，加入 20-50ml DMF 溶解，加入 O. 5-1. 5g NaOH，搅拌下滴加1. 1-1. 5摩尔当量的溴丁酸乙酯在10-20ml DMF中的溶液，室温至60°C反应10-20 小时。乙酸乙酯萃取，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷-乙酸乙酯中重结晶得到白色固体， 为O-硅烷化-N-烷基化克伦特罗；(合成路线如图1b)
C). 0-3. Og步骤(2)中产物，溶入50-100ml四氢呋喃(THF)中，加入1. 5-2. O摩尔当量的氟化四丁基胺(TBAF)，室温反应10-20小时，蒸除溶剂，乙酸乙酯溶解，水洗，干燥， 除去溶剂后在环己烷-乙酸乙酯中重结晶得到白色固体；(合成路线如图1c)
d)0.87-1.74g步骤(3)产物，融入50-100ml I I乙醇/水溶液中，加入 O. 38-0. 76g硼氢化钠，室温反应5-10小时后，除去溶剂，异丙醇中重结晶得到粘稠状物质或者白色无定形固体，为克伦特罗半抗原(合成路线如图ld)，其分子结构如下
权利要求
1.一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述克伦特罗单克隆抗体采用合成的克伦特罗半抗原与载体蛋白偶联得到的抗原进行动物免疫而得到的，克伦特罗半抗原的合成方法包括下述步骤 (1)1. 0-10. Og盐酸克伦特罗加入到20-100ml 二甲基甲酰胺(DMF)中，加入5_25ml三乙胺，10-20%摩尔当量的4-二甲氨基吡啶(DMAP)，0°C下滴加1. 1_1. 5摩尔当量的叔丁基二甲基氯硅烷在10-50ml DMF中的溶液，滴加完毕后，室温继续反应1_10小时，蒸除大部分溶剂，加水，乙酸乙酯萃取，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷-乙酸乙酯中重结晶得到白色固体，为O-硅烷化克伦特罗； (2)1. 0-5. Og步骤(I)所得产物，加入20-50ml DMF溶解，加入O. 5-1. 5g NaOH,搅拌下滴加1. 1-1. 5摩尔当量的溴丁酸乙酯在10-20ml DMF中的溶液，室温至60°C反应10-20小时。乙酸乙酯萃取，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷-乙酸乙酯中重结晶得到白色固体，为O-硅烷化-N-烷基化克伦特罗； (3)1. 0-3. Og步骤(2)中产物，溶入50-100ml四氢呋喃(THF)中，加入1. 5-2. O摩尔当量的氟化四丁基胺(TBAF)，室温反应10-20小时，蒸除溶剂，乙酸乙酯溶解，水洗，干燥，除去溶剂后在环己烷-乙酸乙酯中重结晶得到白色固体； (4)0.87-1.74g步骤(3)产物，融入50-100ml I I乙醇/水溶液中，加入O. 38-0. 76g硼氢化钠，室温反应5-10小时后，除去溶剂，异丙醇中重结晶得到粘稠状物质或者白色无定形固体，为克伦特罗半抗原。
2.根据权利要求1所述的克伦特罗单克隆抗体的制备方法，其特征在于克伦特罗小分子经过结构改造得到带有羧基结构的大分子结构物质N-羧丙基克伦特罗，其分子结构如下
3.根据权利要求1所述的克伦特罗单克隆抗体，其特征在于其制备方法包括以下步骤 (1)将权利要求2所述的克伦特罗半抗原与牛血清白蛋白偶联得到的免疫原对8-10周龄的Balb/c小鼠进行三次间隔免疫，在第三次免疫后再进行一次加强免疫，激活体内的淋巴细胞，产生克伦特罗特异性抗体。
(2)将产生克伦特罗特异性抗体的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按8 I比例进行融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。将阳性细胞采用有限稀释法进行亚克隆，得到稳定的能够分泌克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞。
(3)用液体石蜡致敏Balb/c小鼠，将收集得到的杂交瘤细胞株用1640进行清洗，并注射与小鼠的腹腔。采集到的腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20°C环境保存。
4.如权利要求1所述的克伦特罗单克隆抗体制备的克伦特罗酶联免疫试剂盒，其包括 (1)包被了克伦特罗抗原的96孔酶标板； (2)羊抗鼠酶标二抗； (3)克伦特罗抗体工作液； (4)克伦特罗标准品溶液； (5)底物液A液； (6)底物液B液； (7)终止液； (8)洗涤液。
5.根据权利要求4所述酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的羊抗鼠酶标二抗是采用改良过的过碘酸钠法将所述羊抗鼠二抗与辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶偶联得到。
6.如权利要求4或5所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于当所述标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物A液为pH 5. O，含有O. 75%过氧化氢脲的O. lmol/L柠檬酸-O. 2mol/L磷酸盐缓冲液，底物显色液B液为3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺的乙醇水溶液，所述终止液为2mol/L硫酸；当所述标记酶为碱性磷酸酯酶时，底物显色液为4-硝基酚磷酸钠盐缓冲液，终止液为I 2mol/L的氢氧化钠溶液，所述百分含量为质量百分比。
7.如权利要求4或5所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述包被缓冲液为pH为9.6的O. 05mol/L碳酸盐缓冲液，所述封闭液为pH为7. 4，含有I %牛血清白蛋白，O. 02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述洗涤液为PH7. 4，含有O. 05%吐温-20，O. 02mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为质量百分比。
8.如权利要求4或5的酶联免疫试剂盒，其特征在于克伦特罗标准品溶液的浓度分别为 O μ g/L、0. 025 μ g/L、0. 075 μ g/L、0. 225 μ g/L、0. 675 μ g/L、2. 025 μ g/L。
9.由权利要求3所述的克伦特罗单克隆抗体制备的克伦特罗胶体金试纸卡，其由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫依次粘贴在PVC底板上组成，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的克伦特罗单克隆抗体，所述反应膜上有检测区和质控区，检测区包被有克伦特罗半抗原和载体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。
10.如权利要求9所述的克伦特罗胶体金试纸卡，其特征在于克伦特罗半抗原和载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。
全文摘要
本发明提供了一种克伦特罗单克隆抗体及其应用。本发明公开了一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法，通过合成克伦特罗半抗原以及克伦特罗半抗原与载体蛋白免疫得到克伦特罗抗原，将其免疫动物得到高特异性单克隆抗体。本发明还提供的一种将克伦特罗单克隆抗体应用于克伦特罗酶联免疫试剂盒检测克伦特罗的方法。本发明还提供了一种将克伦特罗单克隆抗体应用于克伦特罗胶体金试纸卡检测检测克伦特罗的方法。本发明制备得到的克伦特罗单克隆抗体特异性高，成本低，以此克伦特罗单克隆抗体制备的克伦特罗酶联免疫试剂盒和胶体金试纸卡检测克伦特罗药物具有操作方便、检测成本低、特异性高、灵敏度高、准确度高、精确度高、检测快速等特点。
文档编号G01N33/577GK103012593SQ20111028218
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日
发明者何方洋, 冯才伟, 付军权, 冯才茂, 聂雯莹, 杨秀贤, 刘福林, 段盈盈 申请人:北京勤邦生物技术有限公司