专利名称：克伦特罗单克隆抗体的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种克伦特罗的特异性单克隆抗体的制备，并用于对饲料及动物性食品中克伦特罗的快速测定，属于检测技术领域。
背景技术：
克伦特罗又叫瘦肉精，属β -肾上腺素受体激动剂类(简称β -激动剂)药物，具有促进动物肌肉生长，减少胴体脂肪含量，改善饲料利用率，显著提高瘦肉率的作用，是最为实用的激动剂之一。克伦特罗在家畜和人体内吸收好，而且与其它兴奋剂相比， 它的生物利用度高，以至食用了含有克伦特罗的猪肉出现中毒。早在1986年欧洲就颁布禁用激动剂的禁令。我国农业部与质检总局也全面禁止该类物质的使用。瘦肉精在上海曾经引发了几百人的中毒事件。而在台湾，由于从美国进口的猪肉里含有瘦肉精，几乎挑起一场政治争端。近年来虽加大了打击非法使用瘦肉精的力度，但在经济利益的驱使下，仍有很多非法使用瘦肉精的情况发生。为了打击非法使用违禁药物，除了健全法律法规，建立有效的监督管理体系外，还需要健全相应的检测方法。申请人通过检索发现，目前国内报道所制备的克伦特罗单克隆抗体的特异性不强，在以单抗为核心所制备的胶体金试纸条的应用中， 未见对不同检测样品的处理方法及最低检测浓度的报道，且目前市场上的试纸条假阳性率偏高。因此克伦特罗的检测远远不能满足快速、廉价、稳定和准确等方面的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法及其在检测克伦特罗上的应用。为实现本发明的目的，技术方案通过如下方式实现一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法，其特征在于以盐酸克伦特罗与牛血清白蛋白的偶联物为免疫原免疫小鼠，再通过细胞融合技术获得杂交瘤细胞，诱生腹水制备出克伦特罗单克隆抗体。所述免疫原是通过重氮法合成的。一种克伦特罗单克隆抗体的应用，其特征在于以克伦特罗单克隆抗体为核心试剂制备检测克伦特罗的胶体金免疫试纸条。所述胶体金免疫试纸条由PVC底板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫几部分组成，其中胶体金结合垫包被有克伦特罗的胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有克伦特罗-载体蛋白偶联物构成的检测线(T)和包被羊抗鼠IgG构成的质控线(C)。所述胶体金免疫试纸条，检测饲料中克伦特罗的最低浓度为0. 005mg · kg_S 动物肌肉和肝脏中克伦特罗的最低浓度为1.6ng· g—1，猪尿中克伦特罗的最低浓度为 1. 5ng · mL-1 ；检测时以控制线(C)和检测线⑴两条显色线作为结果判断的主要依据。1.人工免疫抗原和包被抗原的制备
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精确的称取定量的盐酸克伦特罗溶解在适量的HCl边震荡边向其中缓缓加入 NaNO2,并不断用微量移液器蘸取少许与淀粉碘化钾试纸检测，直到试纸颜色刚好变为蓝紫色，停止加NaNO2，继续震荡使反应充分进行就得到了重氮化的克伦特罗溶液，将重氮化合物分别缓慢加入牛血清白蛋白和卵清蛋白中，震荡反应。4°C冰箱继续放置他后，在4°C冰箱中用PBS连续透析3天。2.克伦特罗单克隆抗体制备及鉴定(1)动物免疫程序将1100 μ g · mLtL-BSA的PBS溶液(0. 22 μ m滤膜过滤除菌)与等体积弗氏完全佐剂混合成乳剂，皮下分点注射健康6周龄雌性BALB/C小鼠，每只 0. 4mL (含CL-BSA100 μ g)，首免2周后同样剂量加强免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂，共免3 次，每次间隔2周，间接ELISA法监测血清抗体效价，选择效价最高的小鼠进行细胞融合，融合前三天以CL-BSA对小鼠进行加强免疫注射。(2)细胞融合与克隆化取经过加强免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过多次亚克隆获得稳定分泌抗克伦特罗的单克隆抗体细胞株5G8。(3)单克隆抗体制备、纯化及鉴定取8 10周龄的BALB/c小鼠，用灭菌石蜡对小鼠进行免疫，10天后腹腔注射所述单克隆抗体细胞株5G8，注射量为5 X IO5个/只，待小鼠腹部明显膨大，采集腹水，用辛酸-硫酸铵盐析法及ftOtein A免疫层析法对腹水纯化， 即得克伦特罗单克隆抗体。通过亚型鉴定得出本发明单克隆抗体的亚型为IgGl型。采用间接竞争ELISA测定抗体特异性及其与同类其它化合物的交叉反应性。3.克伦特罗胶体金免疫试纸条的研制以单克隆抗体为核心试剂制备检测克伦特罗胶体金免疫试纸条，确定免疫胶体金试纸条中各种试剂的配方以及生产工艺，对试纸条性能进行鉴定，并确定了检测样品的前处理方法。本发明的有益效果是通过小鼠杂交瘤细胞珠5G8产生特异性强的克伦特罗单克隆抗体，与其它类药物交叉反应率低，能够大量生产，可用于制备检测克伦特罗的胶体金试纸条，具有灵敏度高、特异性强和操作简便和稳定性好的特点，适合于对大量样品的筛检， 应用前景十分广阔。
图1为本发明纯化后克伦特罗单克隆抗体SDS-PAGE电泳图谱；图2为本发明单克隆抗体与克伦特罗标准品的反应曲线示图；图3为本发明胶体金试纸条的敏感性示图。
具体实施例方式为对本发明进行详细说明，下面结合具体实施例做进一步说明，实施例1人工免疫抗原和包被抗原的合成CL-BSA, CL-OVA的制备(反应在2 4°C条件下进行)。精确称取CL 3. (约 0. Olmmol)溶于 400ul 0. IM HCl (0. 04mmol)，边震荡边向其中缓缓加入10mg/ml的NaNO2 (约O.Olmmol)，并不断用微量移液器蘸取少许与淀粉碘化钾试纸检测，直到试纸颜色刚好变为蓝紫色，停止加NaN02。继续震荡35min使反应充分进行就得到了重氮化的克伦特罗溶液。将重氮化产物缓慢加入溶解与8XPBS(PH8. 6)的蛋白溶液(BSA 和 0VA4ml)，BSA5. Omg(0. 08X l(T3mmol) ；0VA5. Omg(0. IlX l(T3mmol)。使重氮化的克伦特罗与蛋白的分子数量比为50 1左右。检查pH值，pH值8.0仍在以上，继续震荡反应45min。4°C冰箱继续放置Mi后，在4°C冰箱中用PBS (0. Olmol/L)，pH值7. 4连续透析3天，换液8次。重氮盐在与一种芳香胺或苯酚化合时，生成偶氮化合物，而偶氮基是发色基团，观察偶氮后的盐酸克伦特罗滴入蛋白时的颜色变化，初步确认是否偶联成功。由紫外全波长扫描最后计算得CL与BSA偶联比在35 1 ;CL与OVA偶联比在 46 1。由 Gene5 检测系统的 CL-BSA 为 1. lmg/ml ；CL-OVA 浓度为 1. 6mg/ml。实施例2单克隆抗体的制备将1100 μ g -Iiir1CL-BSA的PBS溶液(0. 22 μ m滤膜过滤除菌)与等体积弗氏完全佐剂混合成乳剂，皮下分点注射健康6周龄雌性BALB/C小鼠5只，每只0. 4mL (含CL-BSA 100 μ g)，首免后3周后同样剂量加强免疫，佐剂为弗氏完全佐剂，共免3次，每次间隔2周。在三免以后检测小鼠的抗体效价和阻断情况。方阵法确定ELISA检测抗原最佳包被浓度，通过试验确定包被抗原CL-OVA的包被浓度为0. 8 μ g/ml ；阴性对照浓度为1 2560。再由间接ELISA法检测5只小鼠的血清效价，CL-BSA小鼠血清的效价在1 10240稀释度以上是2、3、4号老鼠，1、5号老鼠血清效价在1 20480稀释度。由以上结果判断对5号老鼠进行冲击免疫。取5号小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，加入HAT培养基，37°C、6% CO2 培养箱中培养。5天后用新鲜HAT培养基换出一半的培养基，8-10天后用HT培养基换出 HAT培养基。每天观察杂交瘤细胞的生长情况，待其分布至孔底面积2/5以上时，取上清液采用间接ELISA筛选特异性抗体，再用有限稀释法进行2-3次亚克隆，检测细胞培养上清， 有细胞的孔阳性率达到100%，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株5G8。取8 10周龄的BALB/c小鼠10只，用灭菌石蜡对小鼠进行免疫，10天后腹腔注射所述单克隆抗体细胞株5G8，注射量为5X IO5个/0. 5mL/只，待小鼠腹部明显膨大，采集腹水，腹水中即含有大量单克隆抗体。以上所述步骤中采用的间接ELISA方法以及方阵实验的方法参照精编免疫学实验指南和临川免疫技术中的方法进行。实施例3单克隆抗体的纯化及其鉴定1.抗体纯化腹水采用辛酸-硫酸铵盐析法及ftOteinA免疫层析法进行纯化，用SDS-PAGE电泳鉴定纯化物，出现51KD的抗体重链条带和^KD的抗体轻链条带(图1)。2.抗体测定方法的建立2. 1单抗5G8效价检测由方阵实验得包被原的浓度在0.79ug，该孔的抗体效价在1 20480倍稀释。
2. 2单抗5G8特异性测定将同系物沙丁胺醇、盐酸克伦特罗配制成1000ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、IOng/ ml、5ng/ml、lng/ml六个浓度，与5G8抗体做间接竞争ELISA试验，判断抗体与同系物沙丁胺醇、莱克多巴胺、去甲肾上腺素和异丙肾上腺素的有无交叉反应。(结果如表1)表1单克隆抗体5G8特异性测定结果
权利要求
1.一种克伦特罗单克隆抗体的制备方法，其特征在于以盐酸克伦特罗与牛血清白蛋白的偶联物为免疫原免疫小鼠，再通过细胞融合技术获得杂交瘤细胞，诱生腹水制备出克伦特罗单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的克伦特罗单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述免疫原是通过重氮法合成的。
3.一种用权利要求1所述的制备方法制备出的克伦特罗单克隆抗体的应用，其特征在于以克伦特罗单克隆抗体为核心试剂制备检测克伦特罗的胶体金免疫试纸条。
4.根据权利要求3所述的克伦特罗单克隆抗体的应用，其特征在于所述胶体金免疫试纸条由PVC底板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫几部分组成，其中胶体金结合垫包被有克伦特罗的胶体金标记物，硝酸纤维素膜上包被有克伦特罗-载体蛋白偶联物构成的检测线(T)和包被羊抗鼠IgG构成的质控线(C)。
全文摘要
本发明公开了一种特异性单克隆抗体的制备方法及其应用，涉及检测技术领域，以盐酸克伦特罗与牛血清白蛋白的偶联物为免疫原免疫小鼠，再通过细胞融合技术获得杂交瘤细胞，制备特异性克伦特罗单克隆抗体，并通过制备的克伦特罗单克隆抗体为核心试剂制备检测克伦特罗的胶体金免疫试纸条。本发明制备的克伦特罗抗体是高特异性的单克隆抗体，具有特异性强、灵敏度高、准确度高等特点；本发明利用该高特异性单克隆抗体为基础制备的试纸条，用于检测克伦特罗残留，具有简便、快速、灵敏、准确、廉价的特点，其应用具有广阔前景。
文档编号G01N33/577GK102432684SQ201110258770
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者吴双, 孙勇, 孟婷, 左伟勇, 李柏林, 洪伟鸣, 王帅兵, 王永娟 申请人:安徽缘远博爱生物技术有限公司