一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体制备方法及用图
【专利摘要】本发明涉及一种新型重组抗TNFα嵌合单克隆抗体制备方法及用途属于生物技术领域。本发明根据仓鼠偏爱密码子设计合成CMAB008抗体的轻链、重链，构建真核表达载体，转染GS基因敲除的CHO-CR-GS-/-宿主细胞，并采用无血清培养技术培养，分离纯化，获得低免疫原性CMAB008抗体，有利于临床应用。
【专利说明】
一种新型重组抗TNF a嵌合单克隆抗体制备方法及用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种新型重组抗TNFa嵌合 单克隆抗体的制备方法及用途。
【背景技术】
[0002] 类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA)是一种以慢性、对称性多关节炎为主 要临床表现的自身免疫性疾病，病情迁延反复。其临床表现为四肢关节红、肿、疼痛，严重影 响患者的生活质量，如不及时治疗，一般2年内就可以造成关节强直畸形，最后导致残疾。 关节滑膜炎症是其主要病理改变，四肢关节则是最易受侵犯的部位。其慢性炎症不仅限于 关节及关节周围组织，还可发生于心、肺、血管等器官和组织。
[0003] 类风湿关节炎是一种世界性疾病，在美国该病的发病率将近1%，随年龄增长发病 率增高，35岁以下成年人发病率约0. 3%，而65岁以上者发病率超过10%。国内发病率略低， 约0. 3%左右，但考虑到我国的人口基数，总发病人数仍很高(约4百万人患病)。
[0004] 类风湿关节炎是一种普遍的、破坏性极高的慢性关节炎症，无法治愈，长期预后效 果差，使个人、社会的经济生活成本大大增加。如未治疗，80%的患者将逐渐丧失行动能力， 寿命平均减少3-18年，在美国，每例患者每年的治疗费用为5919美元，在英国为2600英 镑。目前临床应用的抗风湿药物起效缓慢、疗效有限，副作用较多，且长期预后效果较差。
[0005] 类风湿关节炎的治疗，一般可以分为： 药物治疗： 类风湿关节炎的传统常见治疗药物为：非留体类抗炎药（NSAIDs)，缓解病情的抗风湿 药（DMARDs )，糖皮质激素（GCS )等。
[0006] 非留体抗炎药是类风湿关节炎治疗中最常见的一类药物，其特点是起效快，且可 明显缓解类风湿关节炎的关节肿痛及全身症状，包括传统的NSAIDs如双氯芬酸及C0X-2抑 制剂如美洛昔康、萘丁美酮，该类药物缺点是只能缓解症状，无明显抑制组织滑膜病变进展 的作用。使用时还需注意不应将两种口服剂型的NSAIDs同时服用，避免增加不良反应。该 类药物较易产生较强的胃肠道副反应。而新一代C0X-2抑制剂的长期使用发生心血管事件 的几率增加。
[0007] 缓解病情的抗风湿药是一类可使类风湿关节炎完全缓解的药物，其特点是起效缓 慢，作用持久，可阻止或减缓类风湿关节炎的滑膜破坏。一般在轻症状时可选用一种DMARD， 在较重的患者则应考虑DMARDs的联合应用以控制病情，至完全缓解后可减量或改为一种 DMARD维持治疗。这类药主要有：甲氨蝶呤、柳氮磺砒啶、青霉胺、金诺芬、硫唑嘌呤、羟氯 喹、来氟米特等。
[0008] 糖皮质激素类药物在类风湿关节炎的治疗中，适应征为经正规治疗仍不能缓解的 难治性类风湿关节炎、作为临时缓解症状的过渡性治疗及关节腔内用药。长期使用激素类 药物带来的副作用（高血压，骨质疏松，感染等）更加棘手。此类药物主要有泼尼松、强的松 等。长期服用小剂量激素治疗类风湿关节炎的利弊尚无定论，除非有确切的循证医学依据， 否则不宜提倡。
[0009] 使用药物的内科治疗遵循早期用药，缓解病变的抗风湿药（DMARDs)的合理使用以 及个体化治疗方案的原则。各种治疗方案及治疗指南，强调早期诊断、早期治疗，同时加强 治疗强度，建议诊断后立即给予DMARDs联合治疗，以尽快控制病情发展。但实际的治疗中 部分患者的关节破坏仍可能进一步发展，因而传统药物的治疗效果并不是很理想。
[0010] 生物制剂： TNFa和白细胞介素-1 (Interleukin-1，IL-1)是类风湿关节炎致病机制中最关键 的细胞因子，近年来以TNFa和IL-1等为靶点的生物制剂为RA患者提供了更多的选择。 该类药品直接针对免疫系统内的特定炎症介质，从而有助于迅速控制炎症进展，不仅显著 缓解疼痛和僵硬等症状，还可进一步防止关节损害。国外已上市的此类药物有：由美国 Centocor公司研制生产的Infliximab (商品名"Remicade?")，肿瘤坏死因子受体-抗体融 合蛋白（Etanercept，商品名"Enbrel?"，美国Amgen公司)和重组抗TNF a全人单克隆抗体 (Adalimumab,商品名"Humira?"，美国Abbott公司）。国内上市品种也有注射用重组II型 肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白（商品名"益赛普?"，中信国健；商品名"强克"，上海赛 金)，西安杨森的进口品种注射用英利昔单抗(商品名：类克?)。上述三类TNFa抑制剂可 显著降低类风湿因子和抗环瓜氨酸多肽抗体（CCP)的滴度，据统计此三类药物治疗RA的总 有效率为50-70%。
[0011] 除上述药物，尚有多种生物药处于不同的研究阶段，包括HLA-DR4多肽、 IDEC-131、CII胶原多肽、HLA-DRbl疫苗等，均有望成为治疗RA的有效药物。
[0012] 免疫净化疗法： 对于经正规内科治疗无明显效果，血清中有高滴度自身抗体的难治性类风湿关节炎患 者，可采用免疫吸附及淋巴细胞清除等免疫净化治疗，该方法只有与DMARDs联合应用才可 能使病情长期缓解。该方法包括血浆置换，免疫吸附及淋巴细胞清除等。
[0013] 外科手术治疗： 手术治疗有滑膜切除术、关节融合术、截骨术和人工关节置换术，通常以人工关节置换 和滑膜切除术较常见。不过关节置换术适用于较晚期的畸形并失去正常功能的关节。一般 只适用于年龄超过50岁的患者，因为人工关节的寿命为15~20年，常见的部位是膝、髋和肩 部关节。手术治疗不能治愈疾病，只能改善关节功能和提高病人的生活自理能力。
[0014] 其他治疗方法： 其他治疗方法还有一般治疗方法、植物药治疗、外周血干细胞移植、基因治疗等方法。
[0015] 一般治疗是指病因治疗以外的一些疗法，如心理疗法、运动疗法(恢复期)、关节制 动、卧床休息、理疗和食疗等。对类风湿关节炎的预后有重要影响。
[0016] 植物药中白芍总苷和雷公藤等植物制剂已用于类风湿关节炎的治疗中。
[0017] 干细胞移植法用于重症、难治性的RA。基因治疗虽然起步较晚，但随着人类基因组 工程的完成，该方法也将会成为治疗RA的一大利器。
[0018] 以往研究发现，TNFa在类风湿关节炎的发病过程中起关键作用。TNFa是一种重 要的炎症细胞因子，在正常的免疫功能和引起炎症过程的级联反应中起重要的作用。在类 风湿关节炎病人关节滑液中，TNFa和其他炎症因子大量表达。TNFa作为关键炎症因子， 在炎症过程级联反应中的作用及在类风湿关节炎中可能的机制包括：（1)诱导IL-1，IL-6， IL-8, TGF，GM-CSF等其它炎症因子的合成；（2)刺激前列腺素E2和白三烯B4等炎症介质 的产生；（3)通过上调E-选择素、血管细胞黏附分子及细胞内黏附分子活化白细胞并协助 其向炎症部位渗出；（4)刺激中性粒细胞和纤维原细胞产生胶原酶和基质金属蛋白酶。另 外，TNFa还可诱导细胞凋亡及产生急性相反应。因此阻断TNFa的生成和作用，与阻断其 他细胞因子(如IL-1)相比，更能全面、有效地抑制类风湿关节炎的发展。
[0019] TNF a抑制剂开创了类风湿关节炎治疗的崭新时代。TNF a抑制剂是目前治疗类 风湿关节炎最有效的治疗手段，起效快，疗效确切，尤其是抗TNF a单抗。但最初制备获得 的是鼠源抗TNFa单克隆抗体，用于类风湿关节炎中和TNFa的治疗。但研究发现鼠源单抗 作为治疗药物存在许多缺陷，鼠源单抗用于人体具有强烈的免疫原性，体内消除快，半衰期 短，导致临床疗效有限，副作用大。人源化单抗技术部分克服了抗TNF a鼠源单抗的缺陷。 其中人鼠嵌合抗TNF a单抗（Infliximab，Remicade?)利用基因工程上游构建技术制备获 得，其可变区仍取自鼠源TNF a单抗，保留了与肿瘤坏死因子可溶性片段和跨膜区结合的 特异性和亲和力（Ka = K^M1)，恒定区为人IgGj^恒定区所取代，体内半衰期大大延长。
[0020] Infliximab通过与可溶和跨膜形式TNF a高亲和力的结合，中和TNF a的生物学 活性，阻断TNF a与其受体的结合。同时Infliximab通过抗体依赖的细胞毒作用和补体依 赖的细胞毒作用进一步杀死表达TNF a的细胞。但Infliximab不中和与TNF a共用相同 受体的细胞因子TNFP (又称为淋巴毒素）的作用。
[0021] Remicade?是靶向人TNF a的人鼠嵌合单克隆抗体，包含鼠源可变区和人源恒定 区（IgGO，与人TNF a特异结合(亲和常数为1〇1 :)，分子量为149KDa，为静脉输注用无菌、 白色、冻干粉针，每瓶含Infliximab 100毫克、蔗糖500毫克、聚山梨酯80 0.5毫克、磷酸 二氢钠2. 2毫克和磷酸氢二钠6. 1毫克，不含防腐剂。使用前用10毫升USP无菌注射用水 溶解，PH7. 2,再用生理盐水稀释后静脉滴注。Remicade于1998年8月24日由美国FDA首 次批准上市，用于治疗中重度活动性克罗恩病和瘘管克罗恩病。随后又在欧盟批准上市，并 陆续批准新的适应证，包括类风湿关节炎（RA)、强直性脊柱炎（AS)、银屑病性关节炎、斑块 性银屑病、溃疡性结肠炎和6岁以上儿童的溃疡性结肠炎。该抗体是通过基因重组技术和 哺乳动物细胞连续灌注培养技术生产的重组蛋白。
[0022] 与目前上市的大多数重组抗体类药物不同，Remicade所使用的宿主细胞是SP2/0 细胞，该细胞为小鼠骨髓瘤细胞系，已知有逆转录病毒颗粒分泌。而由于该产品上市较早， 研发者Centocor公司没有掌握无血清培养技术，因而该药在生产过程中使用的是需加入 牛血清的培养基。虽然Remicade十余年的使用过程中表现出良好的疗效和耐受性，全球应 用该抗体的患者累计超过100万人，其中未发现比传统DMARDs更严重的不良反应。但由于 SP2/0细胞中明确的逆转录病毒存在以及生产过程中牛血清的应用，该产品始终存在病毒 污染的风险。另外SP2/0宿主细胞在抗体的翻译后修饰过程中，会产生多种非人的糖基化 修饰，主要包括（NGNA，Gal-a 1，3-Gal)和比例较高的高甘露糖修饰等，在使用过程中可带 来免疫原性。
[0023] Remicade自1998年在美国上市以后，一直是生物抗体类药物的翘楚，属销售额超 过40亿美元的"超级重磅炸弹"级药物。2013年全球最畅销药物中，Remicade位列第三， 销售额超过80亿美金。
【发明内容】
[0024] 为解决上述问题，降低病毒污染风险和减低免疫原性，本发明提供了一种新型 重组抗TNF a嵌合单克隆抗体的制备方法，获得一种新型重组抗TNF a嵌合单克隆抗体 CMAB008。该抗体具有与已上市同类药物的相似生物活性，并且本发明产品CMAB008高甘露 糖形的比例很低，未见Gal-a 1，3-Gal末端半乳糖的连接方式，未见NGNA末端唾液酸修饰， 在使用过程中可降低免疫原性；本发明中采用无血清培养，降低病毒污染风险。
[0025] 本发明公开了 ： 1. 一种新型重组抗TNFa嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： a) -种新型重组抗TNF a嵌合单克隆抗体具有SEQ ID N0 :1所述核苷酸序列的轻链 及具有SEQ ID N0 :2所述核苷酸序列的重链； b) 利用步骤a)所得核苷酸片断构建重组质粒，转染宿主细胞，筛选高表达克隆； c) 优化培养条件，大规模培养，获得新型重组抗TNF a嵌合单克隆抗体，分离纯化。
[0026] 2.上述的一种新型重组抗TNFa嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征是，根据仓 鼠最偏爱密码子设计合成新型重组抗TNF a嵌合单克隆抗体的轻链、重链。
[0027] 3. -种载体，含有权利要求1所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连 的表达调控序列，其中载体可以为pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pcDNA3. 1/ZE0 ( + )，pDHFR之一。
[0028] 4?上述的载体，为 pcDNA3. 1 ( + )或 pcDNA3. 1/ZE0 ( + )。
[0029] 5.上述的一种新型重组抗TNFa嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征是，所述宿 主细胞为真核哺乳动物细胞CH0-CR-GS /。
[0030] 6.上述的一种新型重组抗TNFa嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征是，采用无 血清培养的方式培养宿主细胞。
[0031] 7. -种组合物，含有上述的新型重组抗TNFa嵌合单克隆抗体，和药学上可接受 的载体。
[0032] 8.上述的新型重组抗TNFa嵌合单克隆抗体在制备类风湿性关节炎、强直性脊柱 炎、银屑病性关节炎、斑块性银屑病等药物中的用途。
[0033] 9.上述的组合物在制备类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、斑块性 银屑病等药物中的用途。
[0034] 10.上述任一用途，还包括和其他的治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病 性关节炎、斑块性银屑病等药物联合使用。
[0035] 本发明根据仓鼠的最偏爱密码子，设计合成CMAB008抗体的轻链和重链，连接入 真核细胞高效表达载体中，获得轻链和重链的真核表达载体。本发明利用CRISPR/Cas技术 敲除CH0-K1的GS基因，获得的细胞系命名为CH0-CR-GS /消除了内源性GS表达，更有利于 高表达细胞克隆的筛选。将含有CMAB008的表达载体转染CH0-CR-GS /，筛选高表达克隆。
[0036] 本发明开发了针对CH0-CR-GS /的通用型基础培养基，培养基类型为化学成分限 定性（Chemical Defined,⑶）培养基，即按细胞生长需要将一定比例的氨基酸、维生素、无 机盐、葡萄糖和微量元素等组合成的基础培养基。基础培养基能够初步满足筛选获得的工 程细胞的生长需要，为进一步提高工程细胞目的抗体的产量，对基础培养基进行了针对性 的优化调整，包括添加激素、基因工程重组生长因子，调整氨基酸的量。经过反复比较优 化，其中一优选实施例，确定了适于抗TNF a嵌合抗体工程细胞大规模无血清培养的培养 基（CH0M-B08)和补充培养基（CH0M-S08)，工程细胞在经优化的培养基中表达量大于30pg/ cell, day，利用Fed-batch培养模式，2周培养周期收获的培养上清中，目的抗体的产量可 在3g/L以上。
【附图说明】
[0037] 图1、CMAB008抗体的分离纯化结果 图2、CH0-CR-GS 7工程细胞图 图3、SP2/0细胞图 图4、CMAB008寡聚糖2-AB标记后荧光色谱图 图5、Remicade寡聚糖2-AB标记后荧光色谱图 图6、CMAB008与Remicade生物活性对比结果图 图 7、CMAB008 与 Remicade ELISA 检测结果图。
【具体实施方式】
[0038] 实施例1、CMAB008载体构建 选用仓鼠最偏爱的密码子构建真核高效表达载体，以期在拟用的中国仓鼠卵巢表达体 系中获得更加高效的表达。仓鼠偏爱密码子如表1。
[0039] 表1、仓鼠偏愛密码子
信号肽：选择来自中国仓鼠B细胞抗原受体复合物相关蛋白0链的信号肽。 MATMVPSSVPCHWLLFLLLLFSGSS, ATG GCC ACC ATG GTG CCC TCT TCT GTG CCC TGC CAC TGG CTG CTG TTC CTG CTG CTG CTG TTC TCT GGC TCT TCT。
[0040] 根据仓鼠的最偏爱密码子设计合成CMAB008轻链序列具有SEQ ID NO :1的核苷 酸序列和SEQ ID NO :2的氨基酸序列，CMAB008重链序列具有SEQ ID NO :3的核苷酸序列 和SEQ ID NO :4的氨基酸序列。将上述轻链和重链连接入真核细胞高效表达载体中，获得 轻链和重链的真核表达载体。
[0041] 实施例2、宿主细胞的选择与改造 生物制药领域中宿主细胞的选择需要关注以下几个重要的方面：糖基化及其他翻译后 修饰类型避免带来免疫原性；宿主细胞适于生物反应器的大规模培养，并能在无动物源性 成分的化学成分限定性（chemically defined and animal component free，ACDF)培养基 中生长至高密度；病毒安全性；适于在ACDF中进行克隆及压力筛选。
[0042] 已经获得FDA、EMA批准的多数治疗性单克隆抗体选用CH0细胞作为宿主细胞，另 外还有少量选用小鼠骨髓瘤细胞系，如NS0和SP2/0-Agl4。另外还有BHK21、HEK293、HKB11 等细胞用于蛋白稳定表达的报道。另外还有人视网膜母细胞瘤Per. C6用于抗体稳定表达。 其他用于蛋白稳定表达的细胞还有鸟类胚胎干细胞EB66、人神经元细胞以及转化的人的原 代细胞等。
[0043] CH0细胞可以在生物反应器中高密度生长，易于进行基因操作，N-糖基化类型与 人类相似，较低的病毒传播风险，因此广泛用于生物制药领域。工业生产中最常使用的克隆 为 CH0-K1，CH0-DXB11 和 CH0-DG44。CH0-K1 与原代 CH0 近似，而 DXB11 和 DG44 为经过随机 突变缺失DHFR基因，从而可以通过代谢缺陷标记进行基因扩增。CH0-K1使用GS筛选系统， 但GS在CH0-K1中有内源性表达，因而降低了筛选的效率。
[0044] 与Remicade及Celltrion公司的Inflectra/Remsima不同，本发明选用治疗性抗 体工业化生产应用更加广泛的CH0细胞作为宿主细胞，并对CH0-K1进行了适宜的改造。我 们利用CRISPR/Cas技术敲除了 CH0-K1的GS基因，获得的细胞系命名为CH0-CR-GS /消除 了内源性GS表达，因此更加有利于高表达细胞克隆的筛选。
[0045] 实施例3、转染宿主细胞筛选高表达克隆 脂质体法共转染CH0-CR-GS /，GS筛选系统加压筛选获得高效表达抗TNF a嵌合抗体 的稳定细胞克隆。经过多轮的转染及筛选，获得了表达量大于20pg/Cell. day的细胞克隆。
[0046] 实施例4、无血清培养适应及培养基的优化 我们开发了针对CH0-CR-GS /的通用型基础培养基，培养基类型为化学成分限定性 (Chemical Defined,⑶）培养基，即按细胞生长需要将一定比例的氨基酸、维生素、无机盐、 葡萄糖和微量元素等组合成的基础培养基。基础培养基能够初步满足筛选获得的工程细胞 的生长需要，为进一步提高工程细胞目的抗体的产量，对基础培养基进行了针对性的优化 调整，包括添加激素、基因工程重组生长因子，调整氨基酸的量。经过反复比较优化，最终确 定了适于抗TNF a嵌合抗体工程细胞大规模无血清培养的培养基（CH0M-B08)和补充培养 基（CH0M-S08)，工程细胞在经优化的培养基中表达量大于30pg/cell. day，利用Fed-batch 培养模式，2周培养周期收获的培养上清中，目的抗体的产量可在3g/L以上。
[0047] 实施例5、CMAB008抗体的分离纯化 将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，收集上清，9000rpm*20min，4°C 离心弃去沉淀的细胞及碎片，利用Millipore公司50KD超滤膜包进行超滤浓缩，然后再 9000rpm*30min，4°C离心去除细胞碎片，0. 45iim滤膜进行过滤，利用rProtein A (重组 蛋白A)亲和层析进行初步纯化，原位清洗缓冲液为6M GuCl，柱子用结合缓冲液是20mM PB+150mM NaCl pH7.0,平衡三到五个柱体积后，用洗脱缓冲液20mM Citric Acid (柠檬酸 缓冲液）PH3.0三到五个柱体积进行洗脱，柱平衡清洗后保存于20% EtOH，。rProteinA洗 脱目的Infliximab用Hitrap G25 (GE Healthcare)进行脱盐置换缓冲液，柱子洗脱缓冲 液为PBS (20mMPB+150mMNaCl pH7. 0)，原位清洗液为0. 5M NaOH。以上所有纯化步骤均为 冰上操作，纯化所得嵌合抗体Infliximab经50KD超滤离心管（Merck Millipore)进行浓 缩，最后以紫外吸收法测280nm 0D值定量，Infliximab的紫外0D280吸收系数是1. 35,所 测得0D值除以1.35即得到其浓度（mg/ml)。结果见图1。
[0048] 实验例1、工程细胞透射电镜 结果显示，该产品采用的CH0-CR-GS /工程细胞未见逆转录病毒颗粒(如图2 )，而对 照的SP2/0细胞中则可见明显的逆转录病毒颗粒(如图3 )。
[0049] 实验例2、CMAB008抗体糖基化分析 用pH :8. 0,浓度50mM NH4HC03溶解抗体样品，并与已分装好的重组糖苷酶混合，设定 100ul反应体系，37°C孵育24小时。制备2-AB荧光标记寡聚糖：
检测柱采用ACQUITY UPLC BEH 300 Amide 1.7m 2. 1*100_，荧光检测器进行检测， LC-MS质谱进行糖型确认，结果图4,图5。
[0050] 根据检测结果显示：高甘露形，本发明产品高甘露糖形的比例很低；本发明产品 中未见Gal- a 1，3-Gal末端半乳糖的连接方式；本发明产品中未见NGNA末端唾液酸修饰。
[0051] 实验例2、亲和力分析 本产品与Remicade亲和力相似
实验例3、L929细胞生物活性分析 (1)取对数生长期的L929细胞，胰蛋白酶消化，计数，每次检测（1块96孔板）取约 2*106个细胞，离心弃上清，加入培养液B调整细胞密度至1. 5*10 5/ml，加入96孔培养板中， 0. lml/孔，培养过夜（18-24h)。注意不使用96孔板边缘的孔，但在这些孔中加入无菌水(防 止多孔板的边缘效应)。
[0052] (2)次日用12mL培养液C稀释放线菌素D母液0? 48ml至终浓度为20 ii g/ml，取 2ml作为对照用（培养液D)，其余10ml加入2. 45 iilrh TNF a母液至浓度为4. 9ng/ml (培 养液E)。
[0053] (3)取Remicade?，用培养液E逐步稀释至1000ng/ml。
[0054] (4)将CMAB008用培养液E逐步稀释至1000ng/ml。
[0055] (5)分别在10个1. 5ml无菌离心管中用培养液E连续倍比稀释标准品或样品的稀 释液（即稀释后所有管中含相同浓度的TNF和放线菌素D，但TNF单抗的浓度不同）。（计算 时请注意：因为下一步加入含等体积培养液的孔中，所以实际的稀释度是这时的稀释度的 2倍）。
[0056] (6)将上步所有离心管内的稀释液彻底混匀，10, OOOrpm离心30秒将液体集中于 管底。
[0057] (7)设定培养液E和培养液D分别为阴性对照和阳性对照(加入培养液D的孔，细 胞不受TNF的杀伤；加入培养液E的孔，细胞则受到最大杀伤)。
[0058] (8)接种了 L929细胞的96孔板中，加入稀释好的样品或进口对照品0? 1ml/孔，或 者阴性、阳性对照用培养液。每个点设立2个复孔。置入5% C02,37°C孵箱培养。
[0059] (9) 96孔培养板在孵箱持续孵育14~16h，将新鲜配制的20:1混合的MTS/PMS溶 液加入孔内（20 ill/孔)，再在孵箱中持续孵育1-4小时，用酶标仪测量其A490-A630值。
[0060] (10) Logistic回归：横坐标为标准品浓度，纵坐标为光吸收值的平均数 (A490-A630)〇
[0061] 回归方程：Y = (A-B)/[1 + (X/C)D] + B 根据该方程，C的数值即为半数有效浓度（ED50)。
[0062] 相对中和活性（%)=标准品 ED50 (ng/mL) / 待测品 ED50 (ng/mL) *100% 结果见图6。
[0063] 实验例4、竞争ELISA检测生物活性分析 (l)PBS将TNF-a稀释至〇? lμg/ml，加入酶标板，lOOyl/孔。
[0064] (2 ) 37 °C，包被 2 小时。
[0065] (3)弃去孔中液体，并用PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。
[0066] (4) PBS将牛血清白蛋白稀释至3%，加入酶标板，加满孔。
[0067] (5) 37°C，封闭 2 小时。
[0068] (6)弃去孔中液体，并用PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。
[0069] (7)PBS 将 HRP 标记的 rc TNF mAb 稀释至 0? 34 u g/ml，用 PBS 将 Remicade 稀释至 10 U g/ml，再将二者等体积混匀。
[0070] (8 )PBS 将 HRP 标记的 rc TNF mAb 稀释至 0. 34 u g/ml，用 PBS 将 rc TNF mAb 稀释 至lOii g/ml,再将二者等体积混匀。
[0071] (9) PBS将HRP标记的rc TNF mAb稀释至0. 17 ii g/ml，并用该溶液分别2倍比序 列稀释上两步中的Remicade及rc TNF mAb液体。
[0072] (10)将序列稀释的Remicade及rc TNF mAb加入酶标板，100 ii 1/孔。另外以 0. 17 ii g/ml的HRP标记的rc TNF mAb作为最强显色反应对照，PBS作为最弱显色反应对照。
[0073] (11) 37°C，温育 1 小时。
[0074] (12)弃去孔中液体，并用PBST洗涤3次，每次在吸水纸上拍干。
[0075] (13)将TMB显色底物A及B等体积混合，加入酶标板，100 ill/孔。
[0076] (14)室温避光反应10分钟。
[0077] (15)每孔加入50 ill浓度为0? 5M的硫酸终止反应。
[0078] (16)酶标仪检测0D450nm，630nm为参比波长。
[0079] 结果见图 7。根据文献报道（Ravinder N Maini and Marc Feldmann. How does infliximab work in rheumatoid arthritis Arthritis Res 2002, 4 (Suppl 2) :S22-S28. )，Remicade? 的亲和常数（疋）为 101QM \
[0080] 本产品与Remicade体外生物活性相似。
[0081] 实验例4、安全性： I期单次给药，1、3、10mg/kg，27例入选者，实验室各指标基本正常，不良反应率从高到 低为头晕、肌肉酸痛、发热、腹痛等，均反应轻微，注射相关反应不明显。
[0082] 共27例入组病例中7例出现不良事件，不良事件发生率为25. 9%。
[0083] I期多次给药，0、2、6、10、14周静脉滴注，期间均未出现任何严重不良事件，未发 生注射部位反应(红肿、瘀斑或皮疹)，只有一例出现恶心呕吐，20分钟后缓解。
[0084] 连续多次静脉滴注CMAB008后发生的不良事件
实验例5、免疫原性： (1)单次给药： 检测受试者接受重组抗TNF a人鼠嵌合单克隆抗体后血清抗Chimeric anti-TNFaMAb抗体（ADA)产生情况，于给药前、给药后14、28、56天采集血清样本； lmg/kg剂量组9例受试者中有2例（7#、8#)血清中抗CMAB008抗体检测结果为阳 性，经进一步检测均为非中和性抗体； 单次给药lmg/kg组血清抗抗体检测结果
单次给药lmg/kg组血清中和抗体检测
3mg/kg剂量组和10mg/kg剂量组受试者血清中抗CMAB008抗体检测结果均为阴性。
[0085] 分析7#、8#受试者血清中重组抗TNF a人鼠嵌合单克隆抗体浓度情况，未发现 与其他受试者血清药物浓度有显著性差异。
[0086] 单次给药3mg/kg组血清抗抗体检测结果
单次给药lOrng/kj?组血清抗抗体检测结果
(2)多次给药： 为检测受试者多次给予重组抗TNFa人鼠嵌合单克隆抗体后血清抗CMAB008抗体 (ADA)产生情况，于每次滴注前及最后1次滴注结束后第1、2、4、6、8、12周采血进行血清抗 rc-TNF MAb抗体（ADA)的检测。
[0087] 仅一名受试者J在第三、四、五次滴注前及第五次滴注后1周、2周、4周血清中抗 CMAB008抗体检测结果为阳性，经进一步检测均未非中和性抗体； 多次给药组血清抗抗体检测结果
多次给药组血清中和抗体检测
分析该名受试者J血清中CMAB008的血药浓度情况，未发现与其他受试者血清药物浓 度有显著性差异。
【主权项】
1. 一种新型重组抗TNFa嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： a) -种新型重组抗TNFa嵌合单克隆抗体具有SEQ ID NO :1所述核苷酸序列的轻链 及具有SEQ ID NO :3所述核苷酸序列的重链； b) 利用步骤a)所得核苷酸片断构建重组质粒，转染宿主细胞，筛选高表达克隆； c) 优化培养条件，大规模培养，获得新型重组抗TNF α嵌合单克隆抗体，分离纯化。2. 根据权利要求1所述的一种新型重组抗TNF α嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征 是，根据仓鼠最偏爱密码子设计合成新型重组抗TNF α嵌合单克隆抗体的轻链、重链。3. -种载体，含有权利要求1所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表 达调控序列，其中载体可以为 pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pcDNA3. 1/ΖΕ0 ( + )，pDHFR 之一。4. 权利要求3所述的载体，为pcDNA3. 1 ( + )或pcDNA3. 1/ZE0 ( + )。5. 根据权利要求1所述的一种新型重组抗TNF α嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征 是，所述宿主细胞为真核哺乳动物细胞CH0-CR-GS /。6. 根据权利要求1所述的一种新型重组抗TNF α嵌合单克隆抗体的制备方法，其特征 是，采用无血清培养的方式培养宿主细胞。7. -种组合物，含有权利要求1所述的新型重组抗TNF α嵌合单克隆抗体，和药学上可 接受的载体。8. 权利要求1所述的新型重组抗TNF α嵌合单克隆抗体在制备治疗类风湿性关节炎、 强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、斑块性银屑病等药物中的用途。9. 权利要求8所述的组合物在制备治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病性关 节炎、斑块性银屑病等药物中的用途。10. 权利要求8、9任一所述的用途，还包括和其他的治疗类风湿性关节炎、强直性脊柱 炎、银屑病性关节炎、斑块性银屑病等药物联合使用。
【文档编号】A61K39/395GK105820246SQ201510004710
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月7日
【发明人】钱卫珠
【申请人】上海张江生物技术有限公司