一种人乳铁蛋白单克隆抗体对的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种人乳铁蛋白单克隆抗体对及其用途。
【背景技术】
[0002] "硕鼠"的问世（Palmiteretal.，1982)，加速了转基因生物的研究。克隆绵羊"多 莉"的诞生（Wilmutetal.，1997)，促进了转基因技术在哺乳动物方面的广泛应用。目前研 制成功多种用于生产药用或食用蛋白、提高瘦肉率、改善营养、增强抗病力的转基因猪、牛、 羊（Schniekeetal.，1997;Toledoetal.，2006)，其潜在的经济效益和社会效益巨大，具 有良好的商品化前景。但是由于转基因生物及其产品存在风险，转基因生物及产品的管理 一直受到各国政府的高度重视。
[0003] 为了保护人类自身的健康和生存环境，包括我国在内的许多国家相继制定了转基 因生物安全法规，对转基因生物及产品采用标识制度，对转基因食品进出境进行严格管理。 要使这些法规、制度得以顺利实施，需要有效的检测技术做支撑。目前转基因生物及其加工 食品的检测方法主要包括基因水平的检测和蛋白水平的检测，在蛋白检测方面，目前人乳 铁蛋白的检测方法以ELISA检测法为主，但ELISA方法操作时间较长，而且需要酶标仪等专 业设备，不适用于现场快速检测。因此建立一种快速、简便的检测方法很有必要。
[0004] 目前最适用于现场检测的方法主要是免疫胶体金技术，免疫胶体金技术是以胶 体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸 (HAuC14)在还原剂如抗坏血酸、柠檬酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并 由于静电作用形成一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与 蛋白质分子的正电荷基团牢固结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物 特性。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合 物的免疫和生物学特性，使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领 域。
[0005] 将双抗夹心试纸用于人乳铁蛋白的检测，能够实现人乳铁蛋白的快速简便地检 测；但是，现有的抗人乳铁蛋白的抗体因敏感性和特异性较低且配对性较差，无法满足双抗 夹心免疫试纸检测人乳铁蛋白的要求。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种敏感性和特异性较高且配对性较好的单克隆抗体对，该 抗体对能够满足双抗夹心免疫试纸检测人乳铁蛋白的要求，实现对人乳铁蛋白的快速简便 地检测。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供了一种人乳铁蛋白单克隆抗体对，该人乳铁蛋白 单克隆抗体对由第一单克隆抗体和第二单克隆抗体组成，所述第一单克隆抗体由保藏编号 为CGMCCN0. 10595的杂交瘤细胞株分泌得到，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCC N0. 10594的杂交瘤细胞株分泌得到。
[0008] 本发明还提供了如上所述的人乳铁蛋白单克隆抗体对在制备检测人乳铁蛋白的 试剂盒中的用途。
[0009] 通过上述技术方案，本发明能够通过双抗夹心免疫试纸检测方法，对人乳铁蛋白 的检测取得lOng/mL的灵敏度，对牛乳铁蛋白和羊乳铁蛋白不呈现交叉反应，并且对人溶 菌酶转基因牛、人a-乳清白蛋白转基因牛不呈现交叉反应，具有较高的敏感度和特异性。
[0010] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0011] 生物材料保藏
[0012] 本发明的一株杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编号 为CGMCCNO. 10595,保藏日期为2015年5月8日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究 所，分类命名为杂交瘤细胞株。
[0013] 本发明的另一株杂交瘤细胞株是本发明的发明人自行融合筛选得到的，其保藏编 号为CGMCCN0. 10594,保藏日期为2015年5月8日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研 究所，分类命名为杂交瘤细胞株。
【附图说明】
[0014] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0015] 图1是免疫胶体金试纸的结构示意图。
[0016] 图2是试纸理论检测结果示意图。
[0017] 图3为试纸条特异性试验检测图。
[0018] 图4为部分阳性样品检测图。
[0019] 图5为部分阴性样品检测图。
[0020] 附图标记说明
[0021] 1样品垫 2胶体金垫 3基膜
[0022] 4吸收垫 5T线 6C线
【具体实施方式】
[0023] 以下结合附图对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0024] 本发明提供了一种人乳铁蛋白单克隆抗体对，该人乳铁蛋白单克隆抗体对由第一 单克隆抗体和第二单克隆抗体组成，所述第一单克隆抗体由保藏编号为CGMCCN0. 10595的 杂交瘤细胞株分泌得到，所述第二单克隆抗体由保藏编号为CGMCCNO. 10594的杂交瘤细胞 株分泌得到。
[0025] 本发明还提供了如上所述的人乳铁蛋白单克隆抗体对在制备检测人乳铁蛋白的 试剂盒中的用途。
[0026] 其中，所述检测人乳铁蛋白的试剂盒中可以含有免疫胶体金试纸和/或酶联免疫 试剂，所述免疫胶体金试纸可以含有所述人乳铁蛋白单克隆抗体；所述酶联免疫试剂可以 含有所述人乳铁蛋白单克隆抗体。
[0027] 其中，具体地，该免疫胶体金试纸包括依次相连接的吸水垫、基膜、金标垫和样品 垫；所述基膜上设置有C线和T线，所述C线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述金标垫中含 有胶体金标记的第一单克隆抗体；所述T线上包被有第二单克隆抗体；所述第一单克隆抗 体和所述第二单克隆抗体构成单克隆抗体对，所述单克隆抗体对为如上所述的单克隆抗体 对。
[0028] 其中，免疫胶体金试纸的检测原理可能包括：将待检样品滴入样品垫中，若样品 中有人乳铁蛋白，待检样品中人乳铁蛋白先和胶体金标记的第一单克隆抗体（3B4)结合， 由于毛细管作用，人乳铁蛋白和胶体金标记的第一单克隆抗体形成的复合体沿基膜向前泳 动，到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素基膜上的第二单克隆抗体（5C5)，由于第一单克隆 抗体和第二单克隆抗体分别能结合人乳铁蛋白的不同抗原表位结合，从而形成"胶体金标 记的第一单克隆抗体（3B4)-人乳铁蛋白-第二单克隆抗体（5C5)"复合体，从而使得胶体 金富集在检测线上，形成特异性的红色层析线；没有和人乳铁蛋白结合的胶体金标记的第 一单克隆抗体则会直接通过检测线，达到质控线后被质控线上的羊抗鼠IgG捕获，从而使 得胶体金富集在质控线上形成红色层析线，即判为阳性结果；若样品中无人乳铁蛋白，由于 无法在检测线上形成"胶体金标记的第一单克隆抗体（3B4)-人乳铁蛋白-第二单克隆抗 体（5C5) "复合体，从而使得检测线上不会产生肉眼可见的颜色反应，没有和人乳铁蛋白结 合的胶体金标记的第一单克隆抗体则会直接通过检测线，达到质控线后被质控线上的羊抗 鼠IgG捕获，从而使得胶体金富集在质控线上形成红色层析线，即判为阴性结果。
[0029] 本发明中，使用保藏编号为CGMCCN0. 10595的杂交瘤细胞株和保藏编号为CGMCC N0. 10594的杂交瘤细胞株分别制备和纯化第一单克隆抗体和第二单克隆抗体的方法可以 为本领域常规的方法，例如小鼠腹水法和亲和层析法。
[0030] 本发明中，将单克隆抗体进行胶体金标记的方法可以为本领域常规的方法，例如 可以包括：将0. 01重量％的HAuC14溶液加热煮沸后加入1重量％的柠檬酸三钠溶液直至 溶液的颜色完全变为透明的红色时，继续回流l〇min后停止加热，冷却至室温，即得到胶体 金；取lml制取好的胶体金，用1重量％的1(20)3调节pH值到8.0,加入8yg单克隆抗体， 混合均匀，室温反应40min;加入5重量％的BSA至终浓度为0. 1重量％，静置30min;先用 低速（1500r/min)离心15分钟，弃去由凝聚的金胶粒形成的沉淀；然后用10000r/min离心 30分钟；仔细吸出上清，沉淀物用0.lml含1%BSA的0. 1MPBS(pH7. 4)复溶，加入5%叠 氮钠至终浓度为0. 05%，4°C保存。
[0031] 本发明中，制备免疫胶体金试纸的方法可以为本领域常规的方法，例如可以包括： 用喷金点膜机将第二单克隆抗体和羊抗鼠IgG喷于硝酸纤维素膜上，形成相互平行的检测 T线和质控C线，然后烘干；将胶体金标记的第一单克隆抗体用喷金点膜机均匀的喷在金标 垫上；然后将样品垫、金标垫、喷有T线和C线的基膜（硝酸纤维素膜）和吸水纸依次连接 组装，而后裁切包装备用。
[0032] 其中，所述金标垫中所含有胶体金标记的第一单克隆抗体可以是由5-100yg/mL 胶体金标记的第一单克隆抗体溶液以〇. 5-5yL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在金 标垫上干燥后得到的。
[0033] 其中，所述T线上包被的第二单克隆抗体可以是由0. 2-5mg/mL的第二单克隆抗体 溶液以0. 2-4yL/cm的喷涂速度喷涂在T线上干燥后得到的。
[0034] 其中，所述C线上包被的羊抗鼠IgG的抗体可以是由0.2-5mg/mL的羊抗鼠IgG的 抗体溶液以〇. 2-4yL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在C线上干燥后得到的。
[0035] 以下通过实施例进一步详细说明本发明：
[0036] 实施例1
[0037] 本实施例用于说明人乳铁蛋白单克隆抗体对的筛选。
[0038] 人乳铁蛋白（hLF)的蛋白序列如NCBIGenbank序列号：U95626所示。按照 文献(PenghuaYang,etal. ,CattleMammaryBioreactorGeneratedbyaNovel ProcedureofTransgenicCloningforLarge-ScaleProductionofFunctionalHuman Lactoferrin.，PLoS0NE，2008,3(10)，e3453)中的方法获得人乳铁蛋白（hLF)的转基因乳 牛。
[0039] 向转基因乳牛肌肉注射催乳针（购自西安草滩制药厂生产的不孕牛催乳