抗人pcsk9单克隆抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明为基因工程抗体药物领域，特别是抗人PCSK9的单克隆抗体领域。本发明 涉及人源性功能性抗人PCSK9单克隆抗体，以及这类抗体在治疗人PCSK9介导的疾病中的 用途。
【背景技术】
[0002] 心血管疾病是目前我国首位的死亡原因，其中动脉粥样硬化引起的心脏病、脑卒 中和外周动脉疾病是导致死亡的主要原因，而低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C)水平升高是动 脉粥样硬化性心血管疾病最大的危险因素。他汀类药物是目前降低LDL-C最有效的药物， 但是仍有部分患者的血脂水平未能达标，以及有些患者不能耐受他汀类药物。因此，需要寻 找他汀以外的强效降胆固醇药物，以降低动脉粥样硬化性心血管疾病的风险。
[0003]前蛋白枯草溶菌素转化酶 9(proproteinconvertasesubtilisinkexin9， PCSK9)，又称为神经凋亡调节转化酶 1(neuralapoptosis-regulatedconvertase1， NARC-1)。PCSK9蛋白主要在肝脏中合成和分泌，PCSK9蛋白进入血液循环后，在肝脏与低密 度脂蛋白受体（thelow-densitylipoproteinreceptor,LDLR)结合，介导LDLR降解，从 而降低肝脏对LDL-C的清除能力，升高血浆LDL-C水平。PCSK9基因敲除的小鼠表现出血浆 胆固醇水平大约降低50%，而且使他汀类药物降低血浆胆固醇的灵敏度变高（RashidS，et al2005，ProcNathAcadSci102:5374-5379)。
[0004] 抗PCSK9单克隆抗体可有效阻止PCSK9与LDL-R结合，从而发挥强效降胆固醇的 作用，可用于他汀治疗未达标或他汀不耐受的高胆固醇血症的患者。
[0005] 目前安进研发的PCSK9抑制剂Repatha(Evolocumab)和赛诺菲/再生元研发的 PCSK9抑制剂Praluent(Alirocumab)都已经获得欧洲和美国FDA的批准上市，用于治疗原 发性高胆固醇血症、混合型高脂血症和家族性高胆固醇血症。但是本领域仍然需要更多适 于治疗患者的改善的抗PCSK9抗体。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种新型抗人PCSK9的单克隆抗体或其片段。由本发明涉 及的抗体基因可变区的序列，可构建全长的抗体分子作为药物用于临床上由人PCSK9介导 的疾病使用。这些适应症包括但不局限于下列：原发性高胆固醇血症、混合型高脂血症和家 族性高胆固醇血症。
[0007] 本发明从先前构建的大容量天然人源噬菌体抗体库(抗人IL-17单克隆抗体，专 利申请号201510097117. 0)中筛选并优化得到了全人源抗PCSK9单克隆抗体。
[0008] 本发明的抗体为全人源的单克隆抗体，拮抗至少一种与PCSK9或其部分相关的体 外或体内生物活性。
[0009] 在一个实施例中，本发明抗体的特征在于能够有效抑制PCSK9结合重组人LDLR胞 外区EGF-AB结构域。
[0010] 在一个实施例中，本发明抗体的特征在于对人PCSK9具有强结合亲和力，亲和 力优于（H7B12-IgG4)或与安进公司的同类抗体Evolocumab以及赛诺菲公司的同类抗体 Alirocumab相似。
[0011] 在一个实施例中，本发明抗PCSK9单克隆抗体含有重链可变区多肽，该多肽含有3 个HCDR，其特征在于：所述HCDR1序列为GYX1X2X3NY;所述HCDR2序列为SFYNGN;所述 HCDR3序列为GYVMDX4。其中X1X2X3序列为AIY、TLN或者ALY;X4为I或者F。而且其 中HCDRs序列根据Chothia定义。优选地，本发明抗PCSK9单克隆抗体包含重链可变区多 肽，该多肽具有选自SEQIDNO:16-19的氨基酸序列。
[0012] 在另一个实施例中，本发明抗PCSK9单克隆抗体含有轻链可变区多肽，该多肽 含有3个IXDR序列，其特征在于：所述IXDR1序列为RASQSINNWLD;所述IXDR2序列为 AASTRPS;所述LCDR3序列为QQDQDIPPT。而且其中LCDRs定义根据Chothia定义。优选地， 本发明抗PCSK9单克隆抗体包含轻链可变区多肽，该多肽具有选自SEQIDN0:20的氨基酸 序列。
[0013] 在优选的实施例中，本发明抗PCSK9单克隆抗体含有（i):含HCDR1、HCDR2、和 HCDR3序列的重链可变区，其特征在于：所述HCDR1序列为GYX1X2X3NY;所述HCDR2序列 为SFYNGN;所述HCDR3序列为GYVMDX4 ;其中X1X2X3序列为AIY、TLN或者ALY;X4为I或 者F。而且其中HCDRs序列根据Chothia定义。（ii):含IXDR1、IXDR2、和IXDR3序列的轻 链可变区，其特征在于：所述IXDR1序列为RASQSINNWLD;所述IXDR2序列为AASTRPS;所述 LCDR3序列为QQDQDIPPT。而且其中LCDRs定义根据Chothia定义。
[0014] 在更优选的实施例中，本发明抗PCSK9单克隆抗体的重链可变区序列为SEQID NO:16,轻链可变区序列为SEQIDNO:20;或重链可变区序列为SEQIDNO:17,轻链可变区 序列为SEQIDN0:20;或重链可变区序列为SEQIDN0:18,轻链可变区序列为SEQIDN0: 20;或重链可变区序列为SEQIDNO:19,轻链可变区序列为SEQIDNO:20。
[0015] 本发明抗PCSK9单克隆抗体可包含或由完整的抗体（即全长)、基本上完整的抗体 或其抗原结合部分，例如Fab片段、F(ab'）2片段或单链Fv片段组成。
[0016] 本发明抗PCSK9单克隆抗体包括可变区和恒定区，其中抗体重链恒定区可以是 IgGl亚型（SeqID7)、IgG2(SeqID8)或者IgG4亚型（SeqID9)，轻链恒定区可以是 kappa亚型（SeqID10)或者Lambda亚型（seqID11)。
[0017] 本发明所述的单克隆抗体或其片段是全人源的。
[0018] 本发明抗体的亲和力可以在标准测试方法中进行证明。简言之，测量使用仪器 Biacore3000,将抗人Fe段的抗体偶联至芯片CM5的表面上，稀释抗体蛋白至合适浓度， 保证200RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。将抗体设置一系列的浓度梯度（ex. 100nm， 50nm，25nm，12. 5nm，6. 25nm，3. 125nm，1. 5625nm，Onm)流经固定相表面，测定各单克隆抗体 的亲和力。
[0019] 在一个实施例中，分析了 6种不同抗PCSK9单抗(包括4种本发明的单抗和2种对 照单抗）抑制LDLR与PCSK9结合的能力，结果是均能有效抑制LDLR与PCSK9的结合。
[0020] 本发明抗体在人血清中的稳定性可以在标准测试方法中进行证明。简言之，取过 滤去菌的单抗样品，分别稀释于200ul无菌的正常人混合血清或PBS至终浓度30ug/ml， 混匀后置37°C水浴放置12天（288小时)。12天后，利用ELISA分析血清样品（A:Ab/ normalhumanserum)，PBS样品（B:Ab/PBS)和冻存的单抗样品（C:Ab)与huPCSK9 的结 合，并分别比较各单抗样品结合huPCSK9能力的变化(A/C)。结果表明本发明中的四株抗 huPCSK9单抗具有好的血清稳定性。
[0021] 本发明抗体的抑制PCSK9诱导细胞表面LDLR下调的活性可以在标准测试方 法中进行证明。简言之，将HEK293细胞密度调整至8*10E5cells/ml，接种于24孔板 (500ul/孔)。然后在细胞中加入抗体和PCSK9,悬浮培养3h。然后分别收集各孔中细 胞，用 1%BSA-PBS洗涤 2 次，然后与FITC-anti-LDLR单抗（SinoBiologicalInc.Cat# 10231-R301-F)于冰上孵育45分钟，用PBS洗涤2次后，用BD公司的AccuriC6流式细胞 仪分析FITC信号。以未处理的HEK293细胞为对照，比较各种处理后细胞表面LDLR的水平。 结果显示本发明的抗PCSK9单抗（20ug/ml)能够明显抑制PCSK9诱导的LDLR水平下调。
[0022] 本发明抗体抑制PCSK9诱导细胞摄取LDL-C能力的活性可以在标准测试方法中 进行证明。简言之，将HEK293细胞密度调整至8*10E5cells/ml，接种于24孔板（500ul/ 孔)。然后在细胞中加入PCSK9和抗体，悬浮培养2. 5h。然后再分别在每个孔中补加B0DIPY FLLDL(Invitrogen，Cat#:L3483)至终浓度6ug/ml，继续悬浮培养2.5h。然后分别收集 各孔中细胞，用PBS洗涤2次后，用BD公司的AccuriC6流式细胞仪分析B0DIPY信号（激 发波长488nM，发射波长520)。以未处理的HEK293细胞为对照，比较各种处理后细胞摄取 LDL-C的水平。结果显示本发明的多种抗PCSK9单抗（20ug/ml)能够明显抑制PCSK9诱导 的HEK293细胞摄取LDL-C水平的下调。
[0023]
【附图说明】
[0024] 图1:单抗抑制PCSK9结合人LDLR胞外区EGF-AB结构域。
[0025] 图2 :抗人PCSK9单克隆抗体竞争LDLR结合人PCSK9。
[0026] 图3 :不同抗huPCSK9单抗在在人血清中的稳定性分析。
[0027] 图4 :抗PCSK9单抗抑制PCSK9诱导的HEK293细胞表面的LDLR下调（其中 anti_IL17为一株抗IL17的单抗；Aliro为抗PCSK9的对照单抗Alirocumab;Evolo为抗 PCSK9的对照抗体Evolocumab;H4H4,H7B12,H8A7,H8F4为四株抗PCSK9的单抗）。
[0028] 图5:抗PCSK9单抗抑制PCSK9诱导的HEK293细胞摄取LDL-C能力的下调（其中 anti_IL17为一株抗IL17的单抗；Aliro为抗PCSK9的对照单抗Alirocumab;Evolo为抗 PCSK9的对照抗体Evolocumab;H4H4,H7B12,H8A7,H8F4为四株抗PCSK9的单抗）。
[0029]
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
[0031] 实施例1:各种重组蛋白的制备。
[0032] 制备抗PCSK9单抗的过程中需要用到多种不同的重组蛋白，包括人PCSK9 (huPCSK9，SeqIDNo:l)，小鼠PCSK9(moPCSK9,SeqIDNo:2 )和猕猴PCSK9(mmPCSK9, SeqIDNo:3)，人LDLR胞外区（EGF_AB，SeqIDNo:4 )，以及重组抗体。而这些蛋白都 有大量的翻译后修饰(如：糖基化或二硫键等)，因而利用哺乳动物细胞表达系统将更有利 于保持重组蛋白的结构和功能。此外，为了方便纯化，非抗体类的重组蛋白在C端添加了His-tag(SeqIDNo:5 )或者鼠抗体的Fc段（mFc，SeqIDNo:6)。重组抗体制备时，抗 体重链恒定区可以是IgGl亚型（SeqIDNo:7 )，IgG2亚型（SeqIDNo:8)或者IgG4亚型 (