抗人脂联素的单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫学和生物技术领域，涉及抗人脂联素的单克隆抗体及其应用，更 具体地，涉及利用抗人脂联素的单克隆抗体制备的人总脂联素酶联免疫吸附分析（ELISA) 试剂盒及其大批量检测样本的临床应用。
【背景技术】
[0002] 人脂联素（Adiponectin,又名apMl,Arcp-30,AdipoQ,GBP-28)是由apMl基因编 码，由244个氨基酸残基构成的蛋白分子，具有与胶原VIII、胶原X、补体Clq和TNF-a同 源的结构域。人脂联素主要在脂肪细胞特异表达和分泌，是血液中含量最丰富的细胞因 子，约占总血浆蛋白的0.01%，循环中的脂联素以多聚体形式存在，包括高分子量（high molecularweight，HMW, 12-18聚体及更高）的主要形式、中分子的六聚体（hexameric middlemolecularweight，MMW)和少量的低分子三聚体（trimericlowmolecular weight，LMW)形式。不同形式的脂联素功能有所不同。
[0003] 大量实验表明，脂联素具有广阔应用前景。脂联素可通过不同的途径作用于多个 器官，在一些重要的生理过程中发挥关键的调控作用，包括糖脂代谢、造血、炎症、补体激 活、血栓形成以及抗肿瘤细胞生长等，其分泌失调与许多疾病的发生、发展密切相关。基因 扫描将2型糖尿病、代谢综合征和冠心病的易感基因均定位于3q27,正是脂联素基因所在 区域，脂联素基因突变引起的低脂联素血症与上述疾病发生密切相关。一些抗糖尿病药物 如噻唑烷二酮类更是把增加脂联素的表达作为2型糖尿病改善胰岛素抵抗的治疗靶点。临 床研宄也显示，对于肥胖患者尤其是伴胰岛素抵抗者，脂联素表达水平显著降低，体重减轻 后表达上调，并伴随胰岛素敏感性提升，因此，脂联素可作为反映脂肪组织内分泌功能变化 的重要标志物，不仅可以区分具有不同健康风险的肥胖亚型，还可作为减重效果评价的重 要指标。对于2型糖尿病患者，血中脂联素浓度显著降低，并且降低的程度与与胰岛素抵抗 及糖尿病的进展相平行，可望成为评判2型糖尿病代谢状况的新指标。大量的流行病学证 据还显示，脂联素水平降低可以预测2型糖尿病、代谢综合征、冠心病以及某些肿瘤的患病 风险。因此检测脂联素水平对于上述疾病的早期预测、治疗监控以及预后判断都具有重要 参考价值。除血液以外，新近临床研宄还发现唾液、尿液、关节液以及乳汁等样本中的脂联 素水平也具有不同的检查价值和病理生理意义，从而进一步拓展了脂联素水平检测的临床 意义和发展潜力。
[0004] 目前，检测脂联素的定量方法主要有采用多克隆抗体的竞争性放射免疫分析方法 (RIA)和双抗体夹心分析模式的酶联免疫吸附方法（ELISA)。ELISA方法灵敏度高，特异 性强，标记试剂稳定，无RIA方法的放射污染和危害，因此应用广泛。但现有试剂盒大都受 限于关键试剂如检测抗体不能自己生产，不仅价格昂贵，且质量和稳定性难以长期保障；有 的试剂盒还受限于使用多克隆抗体，多抗供量有限且批间差异大，这样的试剂盒难以适应 大批量长时期开展前瞻性临床研宄的需要；同时，由于循环中存在不同聚合形式的脂联素， 不同方法采用的抗体性质不同，特别是采用多克隆抗体，结合位点不同，与不同聚合形式的 结合能力也不同，因此准确测定各种形式的总脂联素的浓度有很大难度；此外，大多试剂盒 用途单一，没有完整考察是否适用于包括血清/浆、唾液、关节液、乳汁和细胞培养上清等 各类生物样本的大批量检测，也没有详细考察能否检测包括多种分子形式脂联素的总体水 平。
【发明内容】
[0005] 因此，为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种抗人脂联素单克隆抗 体，该抗人脂联素单克隆抗体能结合各种分子形式的脂联素，且质地均一、稳定性好、可长 期大批量生产；本发明还提供了一种操作简便、灵敏度高、成本低、经大样本临床和流行病 学验证，可适用于大批量检测血清/浆、唾液、关节液、尿液及细胞培养上清等各种生物样 本中人总脂联素水平的ELISA试剂盒。此外，本发明的抗人脂联素单克隆抗体还可用于免 疫组化、免疫印迹等多种免疫检测用途。
[0006] -方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为6C3-I或C2001， 其中，
[0007] 杂交瘤细胞株6C3-I的保藏号为CGMCCNo. 9908 (分类命名：人脂联素单克隆抗 体杂交瘤细胞株，保藏日期：2014年11月03日，保藏号为CGMCCNo. 9908,保藏地：中国院 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中 国科学院微生物研宄所，邮编：1〇〇1〇1);
[0008] 杂交瘤细胞株C2001的保藏号为CGMCCNo. 9568 (分类命名：人脂联素单克隆抗体 杂交瘤细胞株，保藏日期：2014年08月18日，保藏号为CGMCCNo. 9568,保藏地：中国院微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研宄所，邮编：100101)。
[0009] 另一方面，本发明提供一种抗人脂联素单克隆抗体A25或C63,其中，所述抗人脂 联素单克隆抗体A25由保藏号为CGMCCNo. 9568的杂交瘤细胞株C2001产生；
[0010] 所述抗人脂联素单克隆抗体C63由保藏号为CGMCCNo. 9908的杂交瘤细胞株 6C3-I产生。
[0011] 本发明的抗人脂联素单克隆抗体通过以下步骤制备：
[0012] 1)制备抗人脂联素单克隆抗体杂交瘤细胞株；
[0013] 2)检测单克隆抗体；
[0014] 3)将杂交瘤的克隆化及扩大培养；
[0015] 4)大量生产、纯化和鉴定单克隆抗体的性质。
[0016] 再一方面，本发明提供一种使用本发明的抗人脂联素单克隆抗体在生物样本中定 量和/或定性检测人脂联素分子中的应用，优选地，所述人脂联素分子为人总脂联素分子， 优选地，所述人总脂联素分子为不同聚合形式的人脂联素分子，进一步优选地，所述人总脂 联素分子的聚合形式为低分子的三聚体、中分子六聚体和高分子12-18聚体或更高聚体。 优选地，所述生物样本为血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、乳汁以及组织细胞提取液或细胞 培养上清等含有脂联素的生物学液体样本。
[0017] 优选地，所述检测的方法为半定量的非变性凝胶电泳免疫印迹法或定量的ELISA 法但不限于ELISA。使用半定量的非变性凝胶电泳免疫印迹法时，将本发明的单克隆抗体用 于混合人血清经非变性凝胶电泳分离后，使用免疫印迹法检测，发现本发明不同的单克隆 抗体具有不同的结合能力，从而可以分辨出不同聚合形式的人脂联素。
[0018] 优选地，所述方法为ELISA方法，该方法包括以下步骤：
[0019] (1)进行夹心结合试验，在单克隆抗体A25和C63中选择最佳配对单克隆抗体； [0020] (2)将两种单克隆抗体中的一种作为固相抗体，使用酶标板包被，另一种作为标记 抗体，使用生物素标记；
[0021] (3)加入酶标亲和素，检测被结合的标记；
[0022] 优选地，所述ELISA方法中，使用单克隆抗体C63作为包被抗体，A25作为标记抗 体。
[0023] 在上述方法中，待测样品可以为血清/浆、唾液、脑脊液、关节液、乳汁以及组织细 胞提取液或细胞培养上清等含有脂联素的生物学液体样本。
[0024] 还一方面，本发明提供一种抗人脂联素单克隆抗体在组织/细胞中检测人脂联素 蛋白表达的应用，优选地，所述方法为免疫组化法；优选地，所述样本为培养的细胞或组织 活检样本。
[0025] 本发明还提供了一种人总脂联素的检测试剂盒，所述试剂盒中包含本发明所述的 抗人脂联素单克隆抗体作为有效成分，优选地，所述检测试剂盒为ELISA试剂盒，更优选 地，所述ELISA试剂盒中的ELISA采用双抗体夹心的非竞争结合法，进一步优选地，所述 ELISA中引入BA放大系统。
[0026] 优选地，所述ELISA试剂盒包括：
[0027] 用于捕获待测样品中的抗人脂联素单克隆抗体C63 ;
[0028] 生物素标记的人脂联素单克隆抗体A25 ;
[0029] 系列包含已知浓度的人脂联素标准品溶液和质控品；
[0030] 酶标亲和素；
[0031] 检测酶标亲和素的工具。
[0032] 优选地，所述试剂盒还包括包被液、磷酸盐缓冲液、阻断液、洗涤液、抗体稀释液、 酶结合物稀释液、底物应用液和/或终止液。
[0033] 优选地