抗人cd98单克隆抗体98-3h3轻、重链可变区基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及抗人⑶98单克隆抗体98-3H3轻、重链可变区 基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 肺癌是全球发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之 一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡 率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位，据统计，我国每年 大约有超过60万人死于肺癌，因此研究肺癌的诊断和治疗具有重要的意义。
[0003] 自1975年Kohler和Milstein创建B淋巴细胞杂交瘤技术以来，各种单克隆抗 体（McAb)相继出现，它们在疾病诊治的基础研究和临床应用方面发挥了积极的作用，其 中肺癌单抗的研制更是为这种难治性肿瘤带来了新的希望。近二十年，关于肺癌单抗的研 究大多为甲胎蛋白和抗生长因子单抗。在肺癌单抗的制备方面，多采用传统免疫方法，即 以可溶性物质或肺癌培养细胞为免疫原，由于肿瘤抗原的变异或部分丢失，因而该方法难 以获得高亲和性、高特异性的肺癌单抗。用肿瘤特异性高表达抗原免疫动物制备单抗已有 成功报道。该法虽然制备抗原麻烦，但能较好地筛选到目的靶点的单抗，不失为治疗性单抗 制备的好方法。
[0004] CD98为细胞表面跨膜蛋白二聚体，通过激活相关蛋白来调控细胞内的信号传导， 进而影响细胞的极性、增殖、黏连、迀移等特性，在肿瘤组织中均有明显高表达，特别是在 肺癌的表达上呈现强阳性表达，该分子的表达提示其表达量可能与肺癌的发生发展密切相 关，有望成为治疗肿瘤的新靶点。
[0005] ⑶98是人细胞表面II型跨膜糖蛋白二聚体，位于11号染色体的SLC3A2基因编码， 在哺乳动物中高度保守。CD98分子是由529个氨基酸组成的糖蛋白，约80kDa。最初发现 该分子的表达与T细胞和B细胞的激活有关。目前的研究显示CD98可以在除血小板以外 的所有细胞表面表达，但在肿瘤中程高表达，其序列和结构在不同物种进化过程中高度保 守，并且在一些处于增殖状态的正常组织如血脑屏障、皮肤的基底层、近端肾小管、胎盘、睾 丸及多种肿瘤组织中高表达。⑶98由一条重链（⑶98hc)和一条轻链（L-type amino acid transporter，LAT)通过二硫键共价连接而成。⑶98hc是溶质载体家族的一员，为单跨膜的 糖蛋白，由529个氨基酸组成：1~81位氨基酸组成胞内区，82~104位氨基酸组成跨膜 区，其中⑶98hc通过二硫键在第109位半胱氨酸位点与轻链共价连接；105-529位氨基酸 组成胞外区，在胞外C末端存在一个突触后密度蛋白结合结构域。
[0006] 目前，确定的CD98的轻链为初在神经胶质瘤中发现的LAT。研究发现，在脊椎动物 中，存在着5种氨基酸转运蛋白：LATl、LAT2、y LATUY LAT-2和xCT，其中任何一种都可以 单独与⑶98hc连接组成⑶98蛋白二聚体。在肺泡上皮中，以LATl为主与⑶98hc连接，在 小肠上皮中，以LAT2为主。⑶98hc在GO期处于低水平表达，但是一旦细胞被激活，GO-Gl 期⑶98hc的表达快速增加，并一直保持着很高的水平，直至细胞周期完成，⑶98hc才开始 降低并于细胞分化成熟后重新处于低水平表达。CD98hc表现CD98的抗原性，在细胞表面， ⑶98hc作为整合素的调节因子，与整合素1特异性结合发挥其调节作用。⑶98hc与整合素 发生作用后，激活磷酯酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K)以及下游 的3,4,5 -三磷酸磷脂酰肌醇，产生整合素样信号通路，从而引发细胞的极性、黏附等特性 的改变，导致疾病的发生和发展。
[0007] -般来说，CD98的轻链是一种不依赖于钠离子的L型氨基酸转运蛋白，能将细胞 外大的、中性的氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、 组氨酸等转运入细胞内合成相关蛋白质。但轻链氨基酸转运蛋白需要与CD98hc共价结合 后，才能发挥其转运氨基酸的功能。研究发现，LAT广泛表达于原发肿瘤及其细胞株，并且 在肿瘤生长和患者预后方面发挥作用。LAT在肿瘤发生发展中的作用机制尚不清楚，目前大 多数的观点认为LAT通过调节胞内相关氨基酸的浓度，实现对信号通路如哺乳动物雷帕霉 素革巴蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路的调控，导致目标蛋白的磷酸 化。这种观点也被相关研究所证实。
[0008] Kurayama等证实胞内亮氨酸浓度能够调节胞内mTOR信号通路，引起p70s6激酶的 激活，进而导致细胞功能的变化。
[0009] 与此不同的是，⑶98的重链却保持了较好的保守性和抗原性。应用⑶98的重链 蛋白即重链区域进行单抗的制备则能获得针对该分子的通用型单抗。
【发明内容】
[0010] 本发明的一个目的在于提供一种抗人⑶98的单克隆抗体98-3H3重链和轻链可 变区基因，以便两者重组后可表达出特异性识别和结合肺癌相关抗原CD98的抗体活性片 段。本发明的另一目的在于所述基因和多肽在制备用于诊断和治疗肺癌药物中的应用。 [0011] 为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
[0012] 一种抗人⑶98单克隆抗体98-3H3轻、重链可变区基因，所述的抗人⑶98单克隆 抗体98-3H3重链可变区基因如SEQ ID N0:1所示；所述的抗人CD98单克隆抗体98-3H3轻 链可变区基因如SEQ ID NO :2所示。
[0013] -种抗人⑶98单克隆抗体，包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区氨基 酸序列如SEQ ID NO :3所示；所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0014] 所述的抗人CD98单克隆抗体在制备治疗肺癌药物中的应用。
[0015] -种杂交瘤细胞株CD98-3H3,所述的杂交瘤细胞株CD98-3H3的保藏编号为CCTCC C2015117,保藏日期：2015年7月8日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏单 位地址：中国.武汉.武汉大学。
[0016] 本发明人应用一套设计的引物成功地从培养的抗肺癌特异性单抗CD98-3H3杂交 瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因；所得VH与VL基因可编码正确的小鼠抗体可变 区。基于上述已克隆到的抗人⑶98单克隆抗体98-3H3轻、重链可变区基因，可以采用基因 工程方法，构建和表达多种小分子基因工程抗体，具备识别肺癌抗原分子的特异性，能够应 用于制备抗肺癌的药物或基因产品。
【附图说明】
[0017] 图1为RT-PCR扩增的抗人⑶98单克隆抗体98-3H3轻、重链可变区基因的琼脂糖 凝胶电泳图，图中M表示DL-2000 Marker，1表示98-3H3重链可变区基因，2表示98-3H3轻 链可变区基因；
[0018] 图2为98-3H3单抗与不同肺癌细胞表达CD98的Western-blot检测结果；
[0019] 图3为98-3H3单抗在肺癌组织中的免疫组织化学染色结果图；
[0020] 以下结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明做具体说明。
【具体实施方式】
[0021] 根据本发明的一个方面，本发明涉及一种抗人⑶98的单克隆抗体98-3H3重链和 轻链可变区基因。该单克隆抗体的重链和轻链可变区基因是从能够分泌较高活性的鼠源性 98-3H3单抗的杂交瘤细胞株CD98-3H3中克隆的。
[0022] 本发明人应用一套设计的引物成功地从培养的抗肺癌特异性CD98-3H3杂交瘤细 胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因。培养物名称：杂交瘤细胞株CD98-3H3 ;保藏编号： CCTCC C2015117 ；
[0023] 抗人⑶98单克隆抗体98-3H3重链可变区基因全长为445bp，其核苷酸序列如序列 表中SEQ ID NO: 1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 3所示。抗人⑶98单 克隆抗体98-3H3轻链可变区基因全长为421bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 2所 示，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，两个基因重组后可用于表达特异性 识别和结合肺癌相关抗原CD98的抗体活性片段。
[0024] 本发明人应用引物成功地从培养的抗肺癌特异性单抗CD98-3H3杂交瘤细胞中克 隆了抗体轻、重链可变区基因。经美国国立生物技术信息中心NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi,2015-11-16) 序列分析平台和頂GT数据库（Lefranc，2001)进行序列分析，结果表明重链同源性最高的 是 Mus musculus clone 7/08PEC Blb IgM 2 immunoglobulin mu heavy chain variable region mRNA(EU934884.l|Length:325);而轻链同源性最高的是：Mus musculus kappa light chain of M