一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术，具体涉及一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方 法。
【背景技术】
[0002] 随着基因工程技术的发展，一些具有生物活性的小分子多肽受到高度重视。人表 皮生长因子（human epidermal growth factor，hEGF)，又称尿抑胃素，是一种由53个氨基 酸组成的约6kD的多肽，主要在十二指肠 Brunner氏腺中产生。hEGF在临床医学领域的应 用主要是：（1)促进外科手术伤口及难愈合创面的愈合。近年来，hEGF在人体烧伤、创伤、糖 尿病性皮肤溃疡、褥疮、静脉曲张性皮肤溃疡上的应用较为广泛，并获得良好效果。（2)促进 眼角膜创伤的愈合。EGF能促进角膜上皮细胞的增殖以用来治疗角膜损伤、溃疡、酸碱烧伤 以及促进移植角膜的存活。（3)对胃肠道溃疡的治疗作用。hEGF有抑制胃酸分泌，防止胃、 十二指肠粘膜损伤及促进胃、十二指肠溃疡愈合的作用。（4)抗肿瘤作用。此外，hEGF在化 妆品领域也有很宽广的应用前景。
[0003] 目前，作为活性多肽的人表皮生长因子的制备多采用生物提取、化学合成或者基 因重组的方法。应用基因工程方法制备重组人表皮生长因子已有大量报道，但以往的表达 都是单拷贝，即使在拷贝丰富的菌株中，由于人表皮生长因子分子量很小，表达量也不能达 到满意的效果，造成宿主表达潜能浪费，产量较低。
[0004] 将多肽基因进行串联表达可解决单拷贝表达产量低的原因：（1)串联增加了多肽 基因数量，有利于提尚表达量；（2)串联多聚体形式的表达可有效屏蔽宿主毒性；（3)多聚 体表达产物更稳定。因此，对人表皮生长因子采用构建多聚体的方法对于提高表达量具有 突出的优势。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的就在于为解决现有技术的不足而提供一种高效表达多拷贝人表皮 生长因子的方法。
[0006] 本发明的目的是以下述技术方案实现的： 一种高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法，包括以下步骤： (1) 人表皮生长因子基因片段的获得：设计引物，在人表皮生长因子基因上游引入限制 性内切酶酶切位点和酵母菌kex2酶切位点，在下游修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列 羧基端ELR变为酵母菌kex2酶切位点EKR，并引入限制性内切酶酶切位点，PCR扩增出目的 片段； (2) 人表皮生长因子定向多拷贝克隆：步骤（1)中扩增出的目的片段经限制性内切酶 酶切、连接，得到目的基因的定向多拷贝克隆； (3) 人表皮生长因子定向多拷贝克隆的酵母表达：将步骤（2)得到的定向多拷贝克隆 转化至毕赤酵母中培养，经酵母菌本身的kex2酶自剪切，获得重组的目的蛋白单体。
[0007] 步骤（1)中人表皮生长因子基因上游引入的限制性内切酶酶切位点为EcoR I和 Bgl II;下游引入的限制性内切酶酶切位点为BamH I、Not I、Sal I。
[0008] 所述步骤（1)中的引物为： OIigol: tagaattcagatctgaaaaaagaaactctgatJctgagtg CSEQIDNQJ-)，其中单下 k?：雜切位点 :01igsl：：： aa?efga￡r!?gagtgtceattgtcccai；gacggtta.ctgtttgQC (.SEQID NO:2.) ； '機霉麵纖_:議踢进藥―纖聲跋聲:⑩灣 播隨3? 0iig〇4 ： ctttggacaagcacgcttgtaactgtgtcgtiggctacaicggtgagagaigtcaatac ?. SEQ ID NO :4)； Ofigo5： tctctict￡ccaccj.ettcaa.gtctcigt3tEga.€Atac￡cac (.SEQ ID NQ'5.)； ：i01§：0:6：治截t组战技激i^e&沒亡沒e枕転 中下划彼浪钱为酶切割位点EKR,双下划直线为L单下划直线为酶 切位点JVW!酶切位点，下划虚线为制I酶切位点。 所述步骤（1)为：将引物通过SOE法获得人表皮生长因子基因片段。
[0009] 所述步骤（2)为：将步骤（1)获得的目的片段经及I和I双酶切，与同样 双酶切的质粒HJC57连接，构建的质粒记作PUC57-hEGF，PUC57-hEGF经你 J 11/ Abii双酶 切后回收hEGF片段；同时经及I/ Ab?/，双酶切后回收PUC57-hEGF片段，将回收的目的 片段经T4连接酶连接，连接混合物转化至大肠杆菌DH5 α中，筛选得到2拷贝人表皮生长 因子串联基因；在此基础上，继续进行酶切、连接可分别得到3拷贝、4拷贝、5拷贝的人表皮 生长因子串联基因。
[0010] 步骤（3)为：将步骤（2)获得的含有人表皮生长因子1-5串联基因的质粒分别经 AcoR I/Abi I双酶切，与同样双酶切的pPIC9K载体连接，经电转化至毕赤酵母GS115,筛选 得到阳性重组子，然后进行诱导表达，获得重组的目的蛋白单体。
[0011] 本发明通过在人表皮生长因子基因片段的上游及下游引入限制酶酶切位点，经酶 切、连接，得到人表皮生长因子成熟肽基因的串联重复序列，克服人表皮生长因子分子量 小，表达量不够的问题，同时在人表皮生长因子基因片段的上游引入kex2酶切位点，在下 游修改部分核苷酸碱基使原氨基酸序列羧基端ELR变为酵母菌kex2酶切位点（EKR)，由于 kex2酶切位点为酵母本身的蛋白酶kex2裂解位点，以保证重组表达的目的蛋白经由酵母 固有的kex2酶切割为单体，显著提高表达量，而无需其它酶的切割处理，并具有天然的N末 端，C端只有一个氨基酸残基的差异却没有冗余氨基酸，而活性却没改变，因其在毕赤酵母 中自然合成，可以保持蛋白质原有的天然状态的空间构象，进而实现了人表皮生长因子的 高效规模化制备。
【附图说明】
[0012] 图1是人表皮生长因子基因克隆至pMD19-T载体的检测结果；M:DNA marker; 1-5 :随即挑选的阳性克隆子菌液PCR结果； 图2是人表皮生长因子基因2-4拷贝串联序列的克隆的检测结果；M :DNA marker ; I :PUC57-2hEGF 质粒 PCR 结果；2-3 :PUC57-3hEGF 阳性克隆子菌液 PCR 结果；4-7 : PUC57-4hEGF阳性克隆子菌液PCR结果。
[0013] 图3是hEGF基因5拷贝串联序列的克隆的检测结果；M :DNA marker ;1 : PUC57-4hEGF质粒PCR结果；2-4 :PUC57-5hEGF阳性克隆子菌液PCR结果； 图4是hEGF基因克隆至pPIC9K载体的检测结果；M :DNA marker ;1-5 :随即挑选的阳 性克隆子菌液PCR结果；6 :空载pPIC9K载体PCR结果； 图5是2拷贝hEGF基因克隆至pPIC9K载体的检测结果；M :DNA marker ; 1-6 :随即挑 选的pPIC9K-2hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；7 :PPIC9K-hEGF质粒PCR结果； 图6是3-4拷贝hEGF基因克隆至pPIC9K载体的检测结果； M :DNA marker ;1-4 :随即挑选的pPIC9K-3hEGF阳性克隆子菌液PCR结果；5-9 :随即挑 选的pPIC9K-4hEGF阳性克隆子菌液PCR结果； 图7是hEGF基因5拷贝串联序列的克隆检测结果；M :DNA marker ;1-4 :PPIC9K-5hEGF 阳性克隆子菌液PCR结果； 图8是EGF1-5串联表达载体EcoR I/Not I双酶切鉴定；M :DNA marker ;1-5 :1-5串联 表达载体双酶切结果； 图9是单拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果；M :Protein molecular marker ;1_4 :菌落1分别诱导24、48、72和96h表达结果； 图10是2拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果；M :Protein molecular marker ;1_4 :菌落1分别诱导24、48、72和96h表达结果； 图11是3拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果； M :Protein molecular marker ;1_4 :菌落 1 分别诱导 24、48、72 和 96h 表达结果； 图12是4拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果；M =Protein molecular marker ;1_4 :菌落1分别诱导24、48、72和96h表达结果； 图13是5拷贝重组表皮生长因子的Tricine-SDS-PAGE分析结果； M :Protein molecular marker ;1_4 :菌落 1 分别诱导 24、48、72 和 96h 表达结果。
【具体实施方式】
[0014] 本发明提供的高效表达多拷贝人表皮生长因子的方法具有普遍应用性，其具有如 下设计方案： 1、根据基因组数据库获得编码人表皮生长因子的基因编码区碱基序列，并商业化合成 模板链和编码链寡核苷酸链。
[0015] 2、合成的寡核苷酸链具有如下特征：编码链的5'端依次具有限制性内切酶EcoR I、Bgl II酶切位点序列、酵母kex2酶切位点序列，3'端依次修改部分核苷酸碱基使原氨基 酸序列ELR变为酵母菌kex2酶切位点EKR，并引入BamH I、Not I、Sail酶切位点序列。
[0016] 3、上述编码链克隆至PUC57载体中，依次经Bgl II/Not I、BamH I/Not I双酶切， 回收目的片段，连接，依次进行，从而获得含有高拷贝的人表皮生长因子基因片段定向连接 单元。
[0017] 4、所获得的高拷贝的人表皮生长因子基因片段定向连接序列经EcoR I/Not I双 酶切后回收目的片段连接到PPIC9K载体上，经电转化至毕赤酵母GS115。
[0018] 5、所述切割位点序列被毕赤酵母内kex2酶自剪切形成活性单体，得到的重组目 的多肽N端为天然末端，C末端与天然多肽只有一个氨基酸差异。
[0019] 6、所述多肽单体混合物经高效液相色谱（HPLC)方法进行深度纯化。
[0020] 7、所述纯化后的感兴趣多肽单体产物的活性测定。
[0021] 在本发明中，术语"定向"是指感兴趣多肽基因 DNA片段按照编码链5' -3'方向相 互连接，还指表达多肽产物按氨基端-羧基端方向相互连接。
[0022] 在本发明中，术语"多拷贝"是指感兴趣多肽基因 DNA片段大于或等于两