治疗多发性骨髓瘤的靶点的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医疗领域，具体涉及一种治疗多发型骨髓瘤的靶点。
【背景技术】
[0002] 多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM)是一种病因尚不清楚的恶性B细胞肿瘤， 特点是骨髓中终末分化的浆细胞的恶性增殖。多发性骨髓瘤在我国每年新发病例为1-2/10 万人口，在血液系统肿瘤的发病率中仅次于白血病和淋巴瘤。若不予治疗，进展期MM患者 的中位生存期仅为6个月。接受传统化疗的患者中位生存期也不超过3年，仅有25%的患 者可以生存5年以上。所以多发性骨髓瘤一直被认为是一种不可治愈的疾病。
[0003] 目前，对初发患者仍然以糖皮质激素（Glucocorticoid，Ge)为代表的化疗方案为 主。这些方案中糖皮质激素地塞米松（Dexamethasone，Dex)发挥了主要的治疗作用，但多 次治疗后患者不可避免地产生耐药，Dex耐药是影响骨髓瘤治疗效果及预后不良的重要原 因。因此，寻找Dex耐药及预后不良相关的治疗靶点并进行有效干预，对于判断预后、指导 治疗，提尚患者生存率有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种新的有实际应用价值的多发性骨髓瘤治疗靶点，以克 目前治疗方法的缺陷，为多发性骨髓瘤病人提供一种新的治疗途径，以进一步提高疗效、改 善病人预后。
[0005] 为实现上述目的，本发明提供一种治疗多发性骨髓瘤的靶点，该靶点为癌基因 CIP2A，所述癌基因 CIP2A氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本发明还提供一种治疗多发性骨髓瘤的靶点，在制备抗多发性骨髓瘤药物中的应 用。
[0007] 本发明的治疗多发型骨髓瘤的靶点，既进一步阐明了多发性骨髓瘤的发病机制， 又为多发性骨髓瘤的治疗提供新的治疗靶点。这一新靶点的发现对开发多发性骨髓瘤基 于癌蛋白的靶向疗法具有重要意义，对改善多发性骨髓瘤病人预后具有潜在的临床应用价 值。
【附图说明】
[0008] 图1所示为本发明治疗多发性骨髓瘤的靶点实施例1-1病人CIP2A表达图。
[0009] 图2所示为本发明治疗多发性骨髓瘤的靶点实施例1-2中4种健康志愿者外周血 单核细胞CIP2A表达图。
[0010] 图3所示为本发明治疗多发性骨髓瘤的靶点实施例1-3中病人的预后指标。
[0011] 图4所示为本发明治疗多发性骨髓瘤的靶点实施例2-1中多发性骨髓瘤细胞系中 CIP2A基因表达图。
[0012] 图5所示为本发明治疗多发性骨髓瘤的靶点实施例2-2中多发性骨髓瘤细胞系中 CIP2A蛋白表达图。
[0013] 图6所示为本发明治疗多发性骨髓瘤的靶点实施例3中多发性骨髓瘤细胞系中 CIP2A敲除后地塞米松的治疗效果图。
【具体实施方式】
[0014] 下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中 描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达 到更好的技术效果。
[0015] 下述实施例中的人 HL-60、U266、RPMI 8226、MM. 1S、MM. IR 均购买自 ATCC。
[0016] 实施例1、CIP2A高表达于多发性骨髓瘤病人细胞，且和病人预后密切相关。
[0017] 1-1、CIP2A高表达于多发性骨髓瘤病人细胞
[0018] 按照如下方法用美天旎的⑶138磁珠分选试剂盒将7例骨髓瘤病人骨髓中⑶138 阳性的肿瘤细胞进行分选：
[0019] (1)将病人标本用RPMI-1640,4倍稀释后，用淋巴细胞分离液分离，400Xg，离心 35分钟，尚心机设置为不刹车。
[0020] ⑵小心吸取中层细胞，用IOml预冷Buffer (含1% FBS，2mM EDTA的PBS，FBS购 自Hyclone，EDTA购自Sigma)洗两次，300 X g，离心10分钟。
[0021] (3)尽量去上清，每5X IO6个细胞加10 μ I MACS⑶138免疫磁珠（购自美天旎）， 90μ1 Buffer，6-12°C放置 15 分钟。
[0022] (4)加入10-20倍的Buffer，300Xg，离心10分钟，洗一次。弃上清加0· 5-lml Buffer，将细胞制成单细胞悬液。
[0023] (5)选择合适的免疫分选柱（购自美天旎），安放柱子在分选器上（美天旎），放 上30 μ m筛网，0.5ml Buffer润柱。将上述细胞过柱，0.5ml Buffer冲柱三次，收集阴性细 胞。
[0024] (6) Iml Buffer推柱得到阳性细胞。
[0025] 荧光定量PCR检测上述分选法分选的7例病人细胞及HL-60细胞中CIP2A基因表 达水平，发现病人细胞均高表达CIP2A(见图1)。实验重复三次。其中，荧光定量PCR检测 以GAPDH为内参基因，荧光定量PCR检测内参基因的PCR引物序列为：
[0026] GAPDH forward primer 5'-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3' ；
[0027] GAPDH reverse primer 5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3' 〇
[0028] 荧光定量PCR检测CIP2A基因表达水平的引物为：
[0029] CIP2A gene forward primer 5'-TGCGGCACTTGGAGGTAATTTC-3' ；
[0030] CIP2A gene reverse primer 5'-AGCTCTACAAGGCAACTCAAGC-3' 〇
[0031] 1-2、CIP2A低表达于正常志愿者细胞
[0032] 按照如下方法用淋巴细胞分离液将4名志愿者外周血的单核细胞进行分选：
[0033] (1)将志愿者的外周血用RPMI-1640,4倍稀释后用淋巴细胞分离液分离，400X g， 尚心35分钟，尚心机设置为不刹车。
[0034] ⑵小心吸取中层细胞，用IOml预冷Buffer (含1% FBS，2mM EDTA的PBS，FBS购 自Hyclone，EDTA购自Sigma)洗两次，300 X g，离心10分钟。尽量去上清，收集细胞。
[0035] 荧光定量PCR检测上述分选法分选的4名志愿者外周血单核细胞及HL-60细胞中 CIP2A基因表达水平，发现健康志愿者外周血单核细胞均低表达CIP2A (见图2)。实验重复 三次。其中，荧光定量PCR检测以GAPDH为内参基因，荧光定量PCR检测内参基因的PCR引 物序列为：
[0036] GAPDH forward primer 5'-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3' ；
[0037] GAPDH reverse primer 5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3' 〇
[0038] 荧光定量PCR检测CIP2A基因表达水平的引物为：
[0039] CIP2A gene forward primer 5'-TGCGGCACTTGGAGGTAATTTC-3' ；
[0040] CIP2A gene reverse primer 5'-AGCTCTACAAGGCAACTCAAGC-3' 〇
[0041] 1-3、高表达CIP2A的骨髓瘤病人表现出预后不良
[0042] 发明人对7例骨髓瘤病人的预后指标进行了分析，包括年龄、骨髓浆细胞含量、血 小板、血红蛋白、白蛋白、本周氏蛋白含量。结果发现高表达CIP2A的三位病人Ρ5-Ρ7，表现 出明显的预后不良，包括年龄大于60岁；骨髓中浆细胞含量大于30% ;本-周氏蛋白含量 大于3. 5mg/L ;血小板、血红蛋白及白蛋白含量较少（见图3)。
[0043] 图1是