用于多发性骨髓瘤损害增量和骨质疏松症的可注射生物可降解性骨基质的制作方法
【专利说明】用于多发性骨髓瘤损害増量和骨质疏松症的可注射生物可 降解性骨基质
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求根据35U.S.C. § 111(b)在2013年3月14日提交的美国临时申请系 列号61/783, 100的优先权，所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文。
[0003] 关于联邦资助研究的声明
[0004] 本发明未获得政府资助。美国政府在本发明中不享有权利。
[0005] 序列表
[0006] 本申请含有已经通过电子方式以ASCII格式提交并因而通过引用方式完整并入 的序列表。2014年3月12日创建的所述ASCII副本命名为420_54894_Sequence_Listing_ D2013-62.txt并且大小为1，289比特。
[0007] 发明背景
[0008] 骨代谢可能受多种医学病症影响。这些病症包括增加骨再吸收性物质的原发性疾 病如骨架中的转移性肿瘤。骨损害和骨折也可能是为了治疗原发性病症所给予的治疗药的 副作用。例如，乳腺癌或前列腺癌的激素治疗可能诱导骨质疏松症。
[0009] 多发性骨髓瘤是第二最常见的血癌，并且造成骨质疏松破坏。骨质疏松破坏（多 发性骨髓瘤患者中的主要并发症）严重影响生活质量。基础性机制是骨再吸收性（破骨细 胞）细胞在恶性细胞产生的异常骨髓微环境中连续分解骨组织。目前，通过施加常规PMMA 水泥进行治疗，所述水泥仅稳定骨折的椎骨，但不支持或诱导骨再生，并且可能在周围组织 中造成损伤，原因在于其惰性和放热特性。此外，通过患者循环系统给予的治疗失衡骨重建 过程的当前药物已经导致明显的并发症。因此，本领域需要用于多发性骨髓瘤以及其他癌 所致骨病的额外和改进疗法。
[0010] 发明概述
[0011] 本文中提供一种包含碱土金属磷酸盐基水泥（cement)、纳米管结构物以及治疗药 或细胞至少之一的骨填充剂组合物，其中所述组合物是固化成硬化团块的糊膏，并且硬化 团块能够释放治疗药或细胞。
[0012] 在某些实施方案中，纳米管结构物包含肽纳米管。在具体的实施方案中，肽纳 米管从Glyn-Aspn肽形成，其中每个η独立地是1至10[SEQIDN0:3]。在具体的实施方 案中，肽纳米管包含肽Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp[SEQIDN0:2](本文也称作 Gly6-Asp2)。在具体的实施方案中，肽纳米管包含选自以下的化合物：Ν，Ν'-双（甘氨酰-甘 氨酸）-己烷-1，6-双羧酰胺；Ν，Ν' -双（甘氨酰甘氨酰甘氨酸）十八烷-1，18-双羧酰胺； 和Ν，Ν'-双（甘氨酰甘氨酸）癸烷-1，10-双羧酰胺。在具体的实施方案中，肽纳米管包含 离子性互补肽。在一些实施方案中，离子性互补肽包含双苯基丙氨酸。
[0013] 在某些实施方案中，纳米管结构物包含碳纳米管。在具体的实施方案中，碳纳米管 经羧基官能化或氨基官能化。在具体的实施方案中，碳纳米管是单壁、多壁或超短碳纳米 管。在具体的实施方案中，碳纳米管包含羧基官能化多壁碳纳米管。
[0014] 在某些实施方案中，纳米管结构物包含肽纳米管和碳纳米管的掺混物。
[0015] 在某些实施方案中，治疗药包含具有结构式式I的化合物：
[0017] 其中L是两个苯基环之间选自一C^C一乙块键、一C_C一乙稀键或C一C一乙 烷键的键；R1和R2各自独立地是在苯基环的任何可用位置处的取代基；m和η各自独立地是 0、1、2、3、4或5,并且m或η至少之一兰1 ;并且R1和R2各自独立地选自：一0Η;卤素；其 中一个C原子用1至3个卤原子置换的卤代烷基；烷基；C2-C6链烯基；C2-(：6炔基和一 0R3,其中妒是^-^烷基、C2-C6链烯基或(：2-(：6炔基；其中R1和R2的至少一次出现是一0H， 前提是当L是一C_C一时，式I的化合物不是白藜芦醇。在具体的实施方案中，治疗药选 自4, 4'-二羟基二苯乙炔（KST-201) ;4_羟-4'-三氟甲基二苯乙炔或4'-羟-4-三氟甲基 二苯乙炔（KST-213) ;3, 4'，5-三羟基二苯乙炔或3'，4, 5' -三羟基二苯乙炔（KST-301);和 3, 3'，5, 5'-四氢二苯乙炔（KST-401)。在具体的实施方案中，R1或R2的至少一次出现是一 0H，前提是（i)当L是一C_C一时，式I的化合物是反式芪并且不是白藜芦醇；（ii)当L 是一(：=(：一时，化合物不是1?1'-201、1?1'-213、1?1'-301或1?1'-401 ;并且（^丨）当1^是一 C一C一时，化合物不是1_ (2, 6- 二氣_4-轻苯基）苯基乙烧。
[0018] 在某些实施方案中，治疗药包含负责破骨细胞分化或活化的信号转导的拮抗剂。 在某些实施方案中，治疗药选自双膦酸盐和RANKL抑制剂。在某些实施方案中，治疗药包 括以下一种或多种：阿仑膦酸盐、唑来膦酸盐、帕米膦酸盐、地诺单抗（Denosumab)、伊班膦 酸盐、唑来膦酸和硼替佐米。在某些实施方案中，治疗药包含具有序列YCWSQYLCY[SEQID N0:1]的肽。在某些实施方案中，治疗药选自：双膦酸盐、雌激素、激素、蛋白酶体抑制剂、促 进破骨细胞的细胞因子拮抗剂和植物化学物质。在某些实施方案中，治疗药选自：阿仑膦酸 盐、阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐、唑来膦酸、雷洛昔芬、地诺单抗、特立帕肽、帕米膦酸二钠、硼 替佐米、卡非佐米、环磷酰胺、盐酸多柔比星脂质体、来那度胺、普乐沙福（plerixafor)、泊 马度胺、SalinosporamideA、MG132、英夫单抗（infliximab)、阿达木单抗（adalimumab)、聚 乙二醇赛妥珠单抗（certolizumabpegol)、戈利木单抗（golimumab)、依那西普、黄噪呤衍 生物、迷幻剂、异黄酮、木脂素、黄酮、黄烷醇、黄酮醇、黄烷酮、儿茶素、没食子酸表没食子儿 茶素（EGCG)、苗、维生素B、维生素D和维生素K。
[0019] 在某些实施方案中，细胞包括间充质干细胞或衍生自间充质干细胞的成骨细胞。 在具体的实施方案中，间充质干细胞或成骨细胞囊化于藻酸盐珠中。在具体的实施方案中， 藻酸盐珠包含羧甲基纤维素。
[0020] 在某些实施方案中，碱土金属磷酸盐基水泥是选自以下的磷酸钙基水泥：羟基磷 灰石私1。(卩04)6(0!1)2);磷酸四钙（1'1^、〇&4(?04)20)、磷酸三钙[€[-1^、€[-0&2(?04)2和 β-TCP、0-Ca3(PO4)2]、无水磷酸氢钙（DCPA、三斜磷钙石、CaHP04)、脱水磷酸二钙（DCPD、钙 磷石、CaHP04·2H20)、和磷酸八钙（0CP、CasH2(P04)6·5H20)。在某些实施方案中，磷酸钙基 水泥基本上由三斜磷钙石组成。在某些实施方案中，碱土金属磷酸盐基水泥包括磷酸镁基 水泥。
[0021] 在某些实施方案中，纳米管结构物以范围从约0.lwt%至约5.Owt%组合物的浓 度存在。在某些实施方案中，纳米管结构物以范围从约0. 5wt%至约2.Owt%组合物的浓度 存在。在某些实施方案中，纳米管结构物以约lwt%组合物的浓度存在。在某些实施方案 中，组合物是可注射糊膏。
[0022] 本文中进一步提供一种产生骨填充剂材料的方法，所述方法包括步骤：分化间充 质干细胞以产生成骨细胞，将成骨细胞囊化于藻酸盐珠中，并且将藻酸盐珠与含有纳米管 结构物的碱土金属磷酸盐基水泥组合物混合。
[0023] 本文中进一步提供一种制备骨填充剂材料复合物的方法，所述方法包括步骤：制 备碱土金属磷酸盐基骨水泥粉末，将粉末与纳米管和预溶解的治疗药混合以形成糊膏，并 添加囊化的细胞至糊膏以形成复合物。在某些实施方案中，通过以下步骤制备碱土金属磷 酸盐基骨水泥粉末：将氢氧化钙或氢氧化镁与包含磷酸的固化溶液混合以形成糊膏，用微 波照射糊膏以形成团块，并且将团块破碎成粉末。在某些实施方案中，细胞囊化于藻酸盐珠 中。在某些实施方案中，纳米管包括肽纳米管。
[0024] 本文中进一步提供一种治疗骨质疏松症的方法，所述方法包括步骤：通过细胞分 化方法从具有骨质疏松症的患者采集间充质干细胞；从间充质干细胞制备成骨细胞；将成 骨细胞并入包含碱土金属磷酸盐基水泥和纳米管结构物的骨填充剂组合物中；并且向患者 递送骨填充剂组合物以治疗骨质疏松症。
[0025] 本文中进一步提供一种治疗多发性骨髓瘤所致骨病和癌症本身的方法，所述方法 包括步骤：将负责破骨细胞分化和/或活化的信号转导的拮抗剂或抑制骨髓瘤肿瘤进展的 治疗药掺入包含碱土金属磷酸盐基水泥和纳米管结构物的骨填充剂组合物的中；并且向有 需要的患者递送骨填充剂组合物。
[0026] 本文中进一步提供一种治疗癌所致骨缺损的方法，所述方法包括注射本文所述的 组合物有需求的受试者的骨缺损中并且允许该组合物固化成硬化团块。在某些实施方案 中，该方法还包括实施骨增量手术。
[0027] 本文中进一步提供一种用于制备骨填充剂组合物的试剂盒，所述试剂盒包含容纳 碱土金属磷酸盐基水泥的第一容器、容纳纳米管源的第二容器；和容纳治疗药或细胞的第 三容器。在某些实施方案中，试剂盒在独立容器中包含治疗药和细胞。在某些实施方案中， 试剂盒还包含藻酸盐和多价阳离子源。在某些实施方案中，试剂盒还包含设置成注射水泥 糊膏的注射器。
[0028] 附图简述
[0029] 本专利或申请文件可以含有一张或多张以彩色完成的图和/或一张或多张照片。 带有彩图和或照片的本专利或专利申请公开文件的副本将在要求和支付必要费用时由美 国专利商标局提供。
[0030] 图1 :制备和通过骨增量技术递送水泥/纳米管/药物/成骨细胞复合物的示例 性图示。
[0031] 图2 :通过加载药物的并入成骨细胞的水泥组合物抑制骨吸收和恢复骨形成的示 例性图示。
[0032] 图3A-3B:从注射器挤出并就操作特性加以评价的含纳米管的水泥（图3A)和单 一水泥（图3B)的照片。这些照片显示当并入碳纳米管时，水泥糊膏的可注射性保留。
[0033] 图4A-4B:碳纳米管的并入改善磷酸钙水泥的机械性能。图4A显示纳米管浓度变 动的水泥的压缩强度（MPa)。图4B显示纳米管浓度变动的水泥的杨氏模量。这些图显示 用具有Iwt%纳米管的水泥实现了最佳机械强度。（DCPA:单独的三斜磷钙石磷酸钙水泥； mCNT:多壁羧基官能化碳纳米管；未处理：无羧基的多壁碳纳米管）。
[0034] 图5A-5D:在磷酸钙水泥（图5A-5B)和磷酸钙水泥/多壁碳纳米管（图5C-5D)上 的7日成骨细胞培养物。
[0035] 图6 :当加载有抗破骨细胞WP9QY[SEQIDN0:1]，一种用于这种治疗的潜在候选药 物时，其中浸没于前破骨细胞培养物中的水泥可以抑制破骨细胞活化。通过计数用细胞因 子TNFα刺激后的TRAP(活跃破骨细胞标志物）阳性细胞，获得数据。
[0036] 图 7A-7B:由自装配表面活性剂样肽Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp[SEQID N0:2] (Glyn-Aspn成员）形成的纳米管的SEM图像。这些图像描述纳米级管状结构的形成。
[0037] 图8 :在碳纳米管（MWCNT) /水泥复合材料中加载时药物MG132的药物释放谱。将 MG132加入水泥中并留下以释放至细胞培养基持续如所示的某个时间段。这种培养基用来 培养指示细胞，随后进行临界染色以显示活细胞。当使用CPC作为药物载体时显示毒性突 发释放效应，但是这种突发释放在碳纳米管存在时衰减。
[0038] 图9 :碳纳米管存在时药物释放的改善。在水泥上加载后，留下MG132以释放于细 胞培养基中持续如所示的某个时间段。将这种培养基添加至用含有NF-kB启动子的萤光素 酶报道分子预转染的细胞以测量细胞因子介导对NF-kB活化的抑制作用。结果显示当添加 碳纳米管时药物更持久地释放。
[0039] 图10 :MG132/MWCNT/CPC复合物阻断破骨细胞分化。
[0040] 图 11 :当干细胞与表面活性剂样肽Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp[SEQID N0:2]形成的纳米管温育1天和3天时，MTT测定法用来测量细