与非侵入性骨增量技术（如后凸成形术或椎体成形术）组合，本公 开的植入物作为可以向疾病部位递送治疗药的载具发挥作用。因为它是高度局限化的，所 以可以精确地操纵治疗的有效浓度。
[0119] 本文所述的组合物特别可用于治疗癌所致骨缺损和骨质疏松症。这些治疗通常包 括递送具有碱土金属磷酸盐基水泥、纳米管、抗破骨细胞药物和干细胞衍生性成骨细胞的 骨填充剂组合物，所述骨填充剂组合物可以单独或与骨增量手术组合递送。在某些实施方 案中，组合物通过协同效应保护骨组织免于多发性骨髓瘤所致的损伤，所述协同效应由各 组分的特定组合整体上协调。每种组分本身可用于骨修复，但是这些跨学科材料和方法的 组合提供超越各种组分的各种益处。
[0120] 在多发性骨髓瘤所致骨破坏的情况下，成骨细胞和破骨细胞介导的骨重建过程的 调节作用失衡是基础性机制。骨髓瘤细胞通过与骨髓间质细胞互作用定位至骨髓。这种 结合作用激活骨髓间质细胞中的核因子（NF)-kB依赖性基因表达，这导致分泌多种细胞因 子，包括肿瘤坏死因子（TNF)α和白介素-6,以及分泌通过几个信号传导级联诱导骨髓瘤 细胞增殖和抑制凋亡的黏附分子。负责诱导破骨细胞再吸收作用的主要机制之一涉及破骨 细胞表达的NF-kB受体激活物（RANK)与其诱导破骨细胞从破骨细胞祖细胞分化的同族配 体RANKL(骨髓间质细胞分泌的细胞因子）结合。TNFa还不仅可以促进骨髓瘤细胞存活和 增殖，还通过与RANKL/RANK无关的机制在破骨细胞分化中发挥作用。因此，已经报道抑制 破骨细胞分化/激活、促进成骨细胞分化/活化、和/或抑制肿瘤进展的药物和补充物可以 与水泥/纳米管组合物组合使用以治疗癌所致骨病。这些包括但不限于，抗再吸收药物和 同化类药物，多发性骨髓瘤或其他肿瘤的抗癌药如靶向NF-kB的蛋白酶体抑制剂、促进破 骨细胞的细胞因子拮抗剂，或已经显示改进骨健康的植物化学物质和维生素。
[0121] 本公开的负载/药物递送系统可以实现治疗药局限于骨损伤部位以避免对其他 组织的出乎意料的副作用。如2图中所示，如本文所述的加载药物的并入成骨细胞的磷酸 钙基组合物可以抑制骨吸收并恢复骨形成。尽管本文中出于示例性目的描述了骨质疏松 症和多发性骨髓瘤，应当理解本文所述的组合物和方法可以用于治疗广泛类型的疾病或病 症。本文所述的组合物可以与任何非侵入性骨增量手术，如，但不限于椎体成形术或后凸成 形术组合。
[0122] 本公开的实施方案还包括确定承保或拒保包括本文所述组合物和方法的疾病或 损伤疗法的健康保险报销和/或支付的方法。在某些实施方案中，治疗包括使用包含碱土 金属磷酸盐基水泥、纳米管、治疗药和成骨细胞的骨填充剂材料，并且健康保险的提供商否 决该治疗的承保或报销。
[0123] 试剂盒
[0124] 进一步构思本文所述的组合物和方法可以体现为单个试剂盒或多个试剂盒的组 成部分。这种试剂盒的非限制性例子包括在独立容器中的碱土金属磷酸盐基水泥、纳米管 源和治疗药，其中容器可以或可以不按联合构造方式存在。许多其他试剂盒是可能的，如 试剂盒还包括干细胞或衍生自干细胞的成骨细胞，试剂盒还包设置成注射水泥糊膏的注射 器，或试剂盒还包括藻酸盐和多价阳离子源。试剂盒还可以包括使用试剂盒的组分以实施 主题方法的说明书。实施主题方法说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以 在试剂盒中作为包装插页存在或在试剂盒的容器的标签中或其部件中存在。在其他实施方 案中，说明书作为电子储存数据文件存在，所述电子储存数据文件存在于合适的计算机可 读取存储介质上，如闪盘驱动器、CD-ROM或磁盘盒。在其他实施方案中，实际说明书不存在 于试剂盒中，但是提供从远程数据源（如通过互联网）获得说明书的手段。这个实施方案 的例子是包含其中可以浏览和/或从中可以下载说明书的网址的试剂盒。与说明书一样， 这种用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。 实施例
[0125] 含碳纳米管的CPC组合物的制备
[0126] 通过使用玛瑙研杵在玛瑙研钵中将Ca(0H)2与固化溶液和去离子水手工混合， 制备水泥糊膏。为了制备15mL固化溶液，分别混入0. 0032g-水合柠檬酸（C6Hs07 ·H20， 100% )、6g碳酸氢钠（NaHC03, >99. 7% )、1. 95mL用于稀释固化溶液的去离子水和13. 05mL 作为磷酸盐源的磷酸（H3P04,85% )。起初，将0. 6175g0&(0!1)2与0. 8mL去离子水混合至 少两分钟以形成Ca(OH)#^-分散于水中的糊膏。最后，将0. 75mL固化溶液添加至这些材 料。将混合的糊膏转移至具有1300W能量输入的家用微波炉并以最大功率焙烘5分钟。使 用研杵，将所得到的团块碾碎为细粉末。随后将lg这种三斜磷钙石粉末与〇. 5mL水或纳米 二氧化硅溶液混合以制备水泥糊膏。
[0127] 将0.Olg羧酸官能化的MWCNT与lg三斜磷钙石粉末混合，同时制备水泥糊膏。将 含纳米管的磷酸钙水泥（图3A)或单独的水泥（图3B)从注射器挤出，输出直径为1. 36mm。 评价浓度变动和纳米管类型对水泥固化时间的影响。表1显示作为碳纳米管wt%的函数 观察到的固化时间变化。如从表1所见，增加糊膏中的纳米管浓度加速初始固化时间和最 终固化时间。图3A-3B显示当随CNT并入时，水泥糊膏的可注射性保留。评价了操作特性 (如固化时间；表1和图3)、机械强度（图4)和生物相容性（图5)，并且结果表明这种纳 米管强化的水泥复合材料是用于骨支架的合适材料。
[0128] 表1 -CNT浓度和类型变动时的水泥固化时间（其中mCNT是多壁羧基官能化的碳 纳米管，并且未处理指无羧基官能化的多壁碳纳米管）
[0129]
[0130] 显示碳纳米管向三斜磷钙石（DCPA)水泥并入改善了水泥的机械性能。使用通用 试验仪以50kN载荷传感器及负载十字头速率设定成0. 5_/分钟，实施单轴压缩试验。如 图4A-4B中所见，从应力-应变曲线生成的杨氏模量显示在含lwt%纳米管的水泥处机械强 度最佳。具有0. 5wt%、l.Owt%和2.Owt%多壁羧基官能化碳纳米管（mCNT)的组合物各自 具有比单一DCPA水泥更大的压缩强度（MPa)。（图4A.)具有未处理的碳纳米管（即，无羧 基官能化的多壁碳纳米管）的组合物具有最低压缩强度。类似地，具有〇.5wt%和l.Owt%mCNT的组合物均具有大于单一DCPA水泥的杨氏模量。（图4B.)
[0131] 为了评价生物相容性，将成骨细胞在单一磷酸钙水泥上并且在含多壁碳纳米管的 磷酸钙水泥上培养7天。图5A-f5D显示7天后这些支架的SEM图像，所述图像显示形成骨 的成骨细胞成熟。
[0132] 掺入作为治疗药的WP9QY
[0133] 将MWCNT/CPC或单一CPC随WP9QY(YCWSQYLCY，[SEQIDNO: 1]) -起加载，WP9QY 是为竞争RANK的配体结合作用和抑制破骨细胞所设计的肽化合物。WP9QY肽具有序列!1_ Tyr-Cys-Trp-Ser-Gln-Tyr-Leu-Cys-Tyr- 0H[SEQIDNO: 1]，并且和基于对TNF受体 1 和 RANK的配体结合位点的结构性分析而开发以抑制破骨细胞活化作用。这种环状肽模拟了 TNF受体1上的最关键肿瘤坏死因子（TNF)识别环，并阻止TNF与其受体相互作用。将肽 直接添加至水泥糊膏以形成骨填充剂组合物。简而言之，与lg水泥粉末混合时，将l〇〇yL lmg/mLWP9QY加入0· 5mL去离子水中。
[0134] 将水泥丸粒用乙醇洗涤并留在经处理以触发细胞分化的前破骨细胞RAW264. 7细 胞培养物中。为了测量从水泥释放的WP9QY的抗破骨细胞成熟，5天后将培养物对TRAP+ (破 骨细胞样）细胞染色。TRAP+是用细胞因子TNFa刺激后活跃破骨细胞的标志物。图6中 所示的结果显示两种复合材料均可以携带并释放WP9QY。如图6中所见，破骨细胞活化被抑 制，显示水泥组合物释放该肽的能力。
[0135] 掺入作为治疗药的MG132
[0136] 相似的方案用来研究药物MG132,所述药物显示出抗NF-kB活化的抑制作用。 MG132是一种蛋白酶体抑制剂，所述蛋白酶体抑制剂用来打断NF-kB的抑制剂降解以阻止 NF-kB的激活及其诱导负责破骨细胞生成的基因表达的活性和溶骨性活性。当制备水泥糊 膏时，将50yL在二甲基亚砜（DMS0)中的10mMMG132或50yL单一DMS0加入去离子水中。 将糊膏在37°C留在6孔平板中以固化，随后进行乙醇洗涤和紫外消毒。将CPC/DMS0、载有 MG132 的CPC(CPC/MG132)、CNT强化的CPC(CPC/MWCNT/DMS0)和载有MG132 的CNT强化的 CPC(CPC/MWCNT/MG132)的每种丸粒浸没于用来培养物指示细胞的2mL培养基中，并且在不 同时间点采集这种条件培养基。活细胞染色显示CPC/MG132有毒的，显示水泥复合材料的 突发释放。然而，通过添加MWCNT，这种效应衰减，如图6中所见。
[0137] 为了进一步评价水泥/药物复合物的释放曲线，实施萤光素酶测定法以测量 MG132对NF-kB激活的抑制作用。在HEK293细胞中转染含有3个拷贝NF-kB结合位点的 报道质粒3XkB-Luc。在24小时后，将培养基更换为上文描述的在不同时间点采集的水泥/ 药物条件培养基。将细胞培养物进一步温育另外一小时，随后用TNFa(20ng/mL)处理8小 时。针对萤光素酶活性制备细胞裂解物。图8中所示的结果显示在纳米管强化的复合材料 中更持久的MG132释放，由其抗NF-kB活性所代表。
[0138] TNFa处理5天后在RAW264. 7培养物中测试载有MG132的水泥的抗破骨细胞生成 作用。在这种情况下，通过实时PCR测量标记基因组织蛋白酶K的表达。图9中所示的结 果显示破骨细胞成熟可以被从水泥释放的MG132抑制。
[0139] 细胞囊化
[0140] 为了在藻酸盐珠中囊化干细胞或成骨细胞，在2%海藻酸钠盐溶液中制备细胞悬 液。通过使用lOmL注射器向2%氯化钙逐滴添加悬液，产生藻酸盐/细胞珠。可以使用共 轴气流从针尖驱动藻酸盐/细胞液滴进入胶凝浴，产生显微级藻酸盐珠。将注射器中充入 的在2%海藻酸钠盐溶液内的细胞悬液输送至产珠装置，所述装置利用lOpsi的氮气以形 成在2%氯化钙中产生藻酸盐液滴的共轴气流。为了加速细胞分化，在藻酸盐/细胞珠的凝 胶化期间添加预载有镁离子的羧甲基纤维素。在成骨性介质中温育7天以诱导成骨细胞分 化后，实施碱性磷酸酶活性测定法以显示形成骨的成骨细胞的成熟。图15中所示的结果显 示这种藻酸盐基基质为细胞分化提供合适环境。
[0141] 肽纳米管的制备和将其掺入水泥组合物中
[0142] 通过自装配过程制备表面活性剂样Glyn_AspJft纳米管。外包定制合成Gly6-Asp2 肽[SEQIDN0:2]。为了制备该纳米管，将Gly6-Asp2[SEQIDN0:2]重悬于去离子水中，调 节pH至中性，并将悬液用超声处理以获得清亮溶液。该肽形成了通过SEM可视并在图7中 显示的纳米管结构物。当干细胞与从Gly6-Asp2[SEQIDN0:2]形成的纳米管温育1天和3 天时用来测量细胞生存力的MTT测定法（图11中所示）显示这种材料安全用于组织中。
[0143] 还从二肽双苯基丙氨酸（一种可以在水溶液中快速形成纳米管的修饰的氨基酸） 制备纳米管。简而言之，100mg/mL双苯基丙氨酸母液通过在1，1，1，3, 3, 3-六氟-2-丙醇中 溶解这种分子来制备。将20μL母液加入lmL去离子水以产生纳米管（图12A)。在固化 期间l〇mg肽纳米管与lg磷酸钙水泥混合（图12B)，显示不破坏结晶。将这些纳米管添加 至干细胞培养物以检验它们的生物相容性。如图12B中所见，细胞在纳米管上贴附并增殖。 细胞生存力测定法还展示细胞贴附作用在并入纳米管的水泥上改善（图13A-D)。
[0144] 具有N，N'_双（甘氨酰甘氨酰甘氨酸）己烷-1，6-双羧酰胺的装配结构的bola两 亲肽可以通过以下三步骤方法制备：（1)制备甘氨酰甘氨酸苄酯盐酸盐，（2)制备Ν，Ν'-双 (甘氨酰甘氨酰甘氨酸）己烷-1，6-双羧酰胺，和（3)制备肽纳米管。甘氨酰甘氨酸苄酯 盐酸盐可以如下制备：将14. 8g叔丁氧羰基甘氨酸-二环己胺和14. 0g甘氨酸苄酯对甲苯