妇科千金方组合物联合抗生素在制备降低血液粘度药物方面的应用的制作方法

本发明涉及医药技术领域，更具体地，涉及一种妇科千金方组合物联合抗生素在制备降低全血粘度药物方面的应用。

技术背景

血液粘度增高会引起血流阻力增加，使血流速度减慢，最后导致血流停滞，直接影响脏器血液供应，导致疾病。全血粘度增高常见于：血浆蛋白异常，如巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、先天性高纤维蛋白血症等，由于血浆中蛋白的含量异常增高，使血浆粘度增高，进而使全血粘度增高。

近年来，随着中医药现代化进程加速，中西药联合应用日趋广泛。妇科千金片主要由千斤拔、金樱根、穿心莲、功劳木(十大功劳)、单面针、当归、鸡血藤、党参八味药组成，为临床治疗慢性盆腔炎的常用药，临床对慢性盆腔炎的治疗亦常采用中西医结合疗法或中药与抗生素联合应用。阿奇霉素适用于敏感细菌所引起的感染，包括支气管炎、肺炎等下呼吸道感染，皮肤和软组织感染，急性中耳炎，鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎等上呼吸道感染。近年来，大量研究报道妇科千金片与阿奇霉素联合应用治疗慢性盆腔炎疗效显著提高，且不良反应发生率明显降低。研究表明，妇科千金片联合阿奇霉素对慢性妇科炎症的疗效优于单用阿奇霉素，因此临床上常将两者合用治疗慢性妇科炎症疾病，相关妇科千金片与抗生素联合应用的研究也多集中在二者联用治疗慢性妇科炎症方面。研究领域和应用领域相对局限。

目前未见妇科千金方组合物与抗生素联合应用于制备降低全血粘度药物组合物方面的相关技术报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是填补现有妇科千金方组合物联合阿奇霉素的应用技术不足，提供妇科千金方组合物联合抗生素在制备降低血液粘度药物方面的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供妇科千金方组合物联合抗生素在制备降低血液粘度药物组合物方面的应用，所述抗生素为阿奇霉素。尤其是在制备降低全血低切还原粘度和/或全血粘度药物组合物方面的应用。

优选地，所述妇科千金方组合物联合阿奇霉素在同时降低全血低切还原粘度和全血粘度方面起到具有明显的作用，可以改善“血瘀”这一病理状态。

优选地，所述妇科千金方组合物中，当归、党参、穿心莲和单面针的掺入量各为药材总重量的9％；金樱根、鸡血藤、功劳木和千斤拔的掺入量各为药材总重量的16％。

优选地，所述妇科千金方组合物为妇科千金片或妇科千金胶囊。

本发明的有益效果如下：

阿奇霉素适用于敏感细菌所引起的感染，包括支气管炎、肺炎等下呼吸道感染，皮肤和软组织感染，急性中耳炎，鼻窦炎、咽炎、扁桃体炎等上呼吸道感染。妇科千金片主要由千斤拔、金樱根、穿心莲、功劳木、单面针、当归、鸡血藤、党参八味药组成，目前有报道将阿奇霉素与妇科千金片联合应用于治疗盆腔炎等妇科炎症，但都是从二者联合抗炎角度进行研究和应用，受到很大的局限。更重要的是，联合应用的机理并不明晰。本发明另辟蹊径，总结发现妇科千金片联合阿奇霉素在降低血液粘度方面良好的应用效果，并通过大量动物实验证明妇科千金片对阿奇霉素改变血流变指标具有确切的影响作用，为中药组合物和阿奇霉素的新领域应用都提供了有力技术支持。

附图说明

图1药物联合治疗前后全血低切还原粘度变化情况。

图2药物联合治疗前后全血高切还原粘度变化情况。

图3药物联合治疗前后高切相对指数变化情况。

图4药物联合治疗前后低切相对指数变化情况。

图5药物联合治疗前后压积变化情况。

图6药物联合治疗前后全血粘度变化情况。

图7药物联合治疗前后红细胞刚性指数变化情况。

图8药物联合治疗前后红细胞聚集指数变化情况。

图9药物联合治疗前后红细胞变形指数变化情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的原料为常规市购或商业途径获得的原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1

1.实验菌种：金黄色葡萄球菌(ATCC25923)，大肠埃希菌(ATCC25922)购

买于中国国家菌种库。受试菌株冻干粉用无菌M-H(B)培养基混悬后均匀铺于无菌M-H(A)平板表面，35℃孵育过夜复活，18h后平板表面生长出菌苔，选取其中长势良好的单一菌团，重新涂抹于M-H(A)斜面，相同条件下孵育18h，密封，4℃条件下冷藏保存；试验前一天取斜面菌涂抹于M-H(A)平板，35℃孵育过夜，即可使用。所有操作均在超净工作台完成。

2.菌液制备方法

方法一：(高浓度菌液制备)

挑3～4个单菌落于40毫升的M-H(B)培养基中。受试菌隔夜增菌培养16小时(37℃，水浴摇床振摇16小时)，次日取出原菌液用全波长多功能读数议测OD值(细菌生长饱和期)；取20mL，分装于离心管中，每管2mL，离心10000～15000rpm/min，10分钟，弃取上清液之中的M-H(B)，用2mL生理盐水混匀后，再离心15000rpm/min，10分钟，弃取上清液中的生理盐水，收集细菌细胞菌体2mL。将相同方法培养的金色葡萄球菌和大肠埃希菌按1：1混合即获得4mL混合菌液。将该菌液为100菌液浓度，用生理盐水进行10倍稀释，稀释至0.1×10⁰，0.01×10⁰，备用(共3个剂量)。

方法二：(低浓度菌液制备)

挑单一菌落(包括金色葡萄球菌和大肠埃希菌)于2毫升的生理盐水中，分别配制成为0.5麦氏浓度(约1×10⁸CFU·mL^－1)细菌混悬液，将金色葡萄球菌和大肠埃希菌混悬液混合，即得到混合菌液4mL。将该菌液设置成为10^A菌液浓度，用生理盐水进行对倍稀释，稀释至0.5×10^A，0.25×10^A，备用(共3个剂量)。

经大量实验总结，方法(一)为受试菌最佳培养方式；0.01×10⁰，为最佳感染菌量；实验方法可以复制大鼠盆腔细菌慢性感染所致“血淤”模型。后续实验采用方法(一)的培养方式，感染菌量为0.01×10⁰。

3.药品与试剂：M-H(A)培养基(OXOID公司，生产批号：CM0337A)；M-H(B)培养基(OXOID公司，生产批号：CM0405B)；乌拉坦溶液(20％)；生理盐水(四川科伦药液股份有限公司，生产批号：M12012004)；其他试剂和耗材均由成都雅荣生化设备经营部购买提供。妇科千金片或妇科千金胶囊购自株洲千金药业股份有限公司。

4.仪器：电热恒温培养箱(上海一恒科技有限公司，BPH-9162)；优普系列超纯水机(成都超纯科技有限公司，UpK-1-10T)；微量加样器(EppendorfResearch，10、100、100uL)；空气浴振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发，HZQ-C)；自动电热压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂，LDZX-40BI)；全波长多功能读数议(美国Thermo)；菌落计数仪。

5.炎症导致“血瘀”模型制备

本发明人基于长期大量的研究，分析总结血液的活动性不仅是保证血液正常循环活动和组织器官正常的血液供给，也是促使组织和器官执行其正常生理功能和维持机体内环境恒定的重要因素，以及影响机体免疫功能和体液调节功能的重要因素。血流变学的改变主要包括毛细血管通透性增高，血流速度减慢及血液粘滞性增高等异常情况。血液流变性异常可导致血液循环和微循环的障碍，引起组织缺血、缺氧、代谢和功能失调等一系列严重后果。大量临床试验研究已证实CPID患者大都存在着不同程度的血液流变学的异常，与正常妇女比较有显著性差异，即血液都处于“浓、黏、凝、聚”状态，当血液黏度增高时血液流量减少，易造成组织缺血致血瘀。为顺利实现验证本发明方法，本实施例选择建立炎症反应导致的“血淤”型实验模型进行血液粘度变化的研究。

具体操作方法：大鼠称重标记，腹部常规消毒，20％乌拉坦0.5mL/100g腹腔注射麻醉，用1mL注射器抽取预先制备的混合菌液，左手持鼠尾提起大鼠，用10mL注射器磨去针头尖，于阴道底部的子宫颈分叉处小心进入一侧宫腔内，针头在宫腔内来回抽拉2次以机械性损伤子宫内膜组织，然后朝卵巢方向推注菌液0.1mL，同样操作步骤将0.1mL菌液注入另一侧子宫，注射完毕后，倒置大鼠5min，以防菌液漏出。分别于24h，48h观察记录各组大鼠感染情况，以大鼠无死亡，于造模后24h、72h、96h后分别阴道刮片，进行菌落培养，选择菌落计数≥30，≤100的感染菌量作为最佳感染菌量。将该菌量作为体内感染的菌量。受试大鼠感染菌量为：

表1

所有实验动物于造模后24h、72h和96h，麻醉，常规消毒腹部，用无菌棉签伸入宫口，来回抽拉2次后，将棉签放入含2mL生理盐水的试管中，获得含测试品混悬液，取出棉签，再用新的无菌棉签充分蘸取混合液均匀涂抹于无菌M-H(A)平板表面，35℃孵育过夜，18h后进行菌落计数。240h牺牲动物，观察子宫感染情况。各组典型鼠感染菌落计数，结果如下表2：

表2受试大鼠感染菌量

所有实验动物于造模后24h、72h和96h，麻醉，常规消毒腹部，用无菌落计数结果显示，3组鼠所感染菌量符合实验要求。同时，解剖后可见子宫等直观可见炎性充血与炎性水肿。

6.试验过程

模型大鼠随机分为5组，即model、AZM、AZMQR、AZMDG、AZMFF(分别表示不予治疗的模型组、单独使用阿奇霉素组、阿奇霉素清热合并组、阿奇霉素缺当归合并组、阿奇霉素全方合并组)。

Model：不予治疗的模型组；

AZM：阿奇霉素治疗模型组。

AZMQR：阿奇霉素+以千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针按照妇科千金片配方中的比例和方法制得组合物联合治疗模型组。

AZMDG：阿奇霉素+以千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针、鸡血藤、党参按照妇科千金片配方中的比例和方法制得制得组合物联合治疗模型组。

AZMFF：阿奇霉素+妇科千金片(包括千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针、当归、鸡血藤、党参成分，株洲千金药业股份有限公司出品)联合治疗模型组。

1.受试剂量

(1)AZM剂量：本实施例对阿奇霉素(AZM)的可选受试剂量进行了分析和确定，目的为选择一个试用后作用强度适中、时长适中的受试剂量，同时明确同中药合并用药时的时程长度。预试60、30、20、10mg/kg.d三天，发现原设定剂量过高，最终采用10mg/kg.d。

(2)受试药物剂量：

原设定妇科千金方全方(AZMFF)为2.058g/kg.d，但预试发现，此剂量采用最大给容积配制的给药液为稀浆状，无法通过灌胃针头。随调整最终全方AZMFF给药剂量为最大给药量1.66g/kg.d，调整缺当归组剂量DG为1.41g/kg.d、清热组剂量QR为1.16g/kg.d。

2.给药时间

除空白和模型外，造模后第六日开始给予相应药物。AZM与各中药分别给予，相差时间约2小时。所有给药组在8点左右均先给予相应剂量的AZM，两个小时后开始给予相应的中药生理盐水水混物。

3.样本收集

第1日给予AZM两小时后，经尾静脉采集各组大鼠末梢静脉血。从第二日始各给药组大鼠每日两次采血，于给予阿奇前和给予中药前各经尾静脉采集一次，每次采集血量约0.3mL，取样时间误差约30min。于给药第2、4、6、8日给予AZM两小时后，各组麻醉后牺牲约2～4只大鼠，采集下腔动脉抗凝全血。

4.送样测试

所有时间点0.3mL及末次全血，末次抗凝全血送检血细胞计数、血流变。

实验结果见图1至图9所示。每个附图中，从左至右分别显示为AMZ、AMZDG、AZMFF、AZMQR、Model和正常组normal的指数变化情况。结果显示，实验动物造模后，全血低切还原粘度、全血粘度和红细胞聚集指数，与正常组比较均升高，给予不同的药物组合治疗后，各指数都降低，趋向于回复正常水平。各治疗组之间的治疗效果比较，全血低切还原粘度：AZMFF>AZM>AZMDG>AZMQR；全血粘度：AZMFF>AZMDG>AZMQR>AZM。试验证明，妇科千金方联合阿奇霉素在血液流变状态改变中起到有效作用，尤其是在降低全血低切还原粘度和/或全血粘度方面起到具有明显的作用，可以改善炎症引致的“血瘀”这一病理状态。

实施例2应用于改善其他血瘀症状的试验

1.大鼠急性血瘀模型：

健康SPF级SD大鼠，220g±20g，雌性，60只。由四川省医学科学院实验动物研究所购得，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2008-24)。大鼠皮下注射0.8mg﹒kg^-1盐酸肾上腺素(天津金耀氨基酸有限公司)、冰浴时间4min、最后一次注射盐酸肾上腺素后间隔12h颈总动脉后插管取血。

2.模型分组和给药

大鼠随机分成3组，每组20只：对照Ⅰ组(灌胃等体积生理盐水)；血瘀模型Ⅰ组每日早晚分别灌胃给药1次，共7次。(可于第7次给药后颈总动脉取血，进行测定。测定可以采用LG-R-80B电脑血液粘度测试仪测定全血粘度，用温氏管法测定血沉和红细胞压积，验证是否成功造模。

3.实验过程和结果

高血粘度模型大鼠随机分为3组，即model、AZM、AZMFF(分别表示不予治疗的模型组、单独使用阿奇霉素组、阿奇霉素与妇科千金片全方合并组)。

Model：不予治疗的模型组；

AZM：阿奇霉素联合治疗模型组。

AZMFF：阿奇霉素+妇科千金片(主要成分为千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针、当归、鸡血藤、党参，株洲千金药业股份有限公司出品)联合治疗模型组。

A.AZM剂量：本实施例对阿奇霉素(AZM)的可选受试剂量进行了分析和确定，目的为选择一个试用后作用强度适中、时长适中的受试剂量，同时明确同中药合并用药时的时程长度。预试60、30、20、10mg/kg.d三天，发现原设定剂量过高，最终采用10mg/kg.d。

B.受试药物剂量：

原设定妇科千金方全方(AZMFF)为2.058g/kg.d，但预试发现，此剂量采用最大给容积配制的给药液为稀浆状，无法通过灌胃针头。随调整最终全方AZMFF给药剂量为最大给药量1.66g/kg.d。

(2)给药时间

除空白和模型外，造模后第六日开始给予相应药物。AZM与各中药分别给予，相差时间约2小时。所有给药组在8点左右均先给予相应剂量的AZM，两个小时后开始给予相应的中药生理盐水水混物。

(3)样本收集

第1日给予AZM两小时后，经尾静脉采集各组大鼠末梢静脉血。从第二日始各给药组大鼠每日两次采血，于给予阿奇前和给予中药前各经尾静脉采集一次，每次采集血量约0.3mL，取样时间误差约30min。于给药第2、4、6、8日给予AZM两小时后，各组麻醉后牺牲约2～4只大鼠，采集下腔动脉抗凝全血。

(4)送样测试

所有时间点0.3mL及末次全血，末次抗凝全血送检血细胞计数、血流变。实验效果标准：

1.显效：用药后全血粘度降至正常范围者。

2.有效：全血粘度较前下降至接近参考值。

3.无效：血粘度下降不明显者。

Model和AZM的各20例中，显效0例，占0％；有效0例，0％；无效20例，占100％；总有效率为0％。AZMFF 20例中，显效6例，占30％；有效11例，55％；无效3例，占15％；总有效率为85％。

实施例3应用于改善其他高血粘度症状的试验

1.动物和分组：健康SPF级SD大鼠，220g±20g，20只。由四川省医学科学院实验动物研究所购得，实验动物生产许可证号：SCXK(川)2008-24)。大鼠随机分成4组，每组5只：对照Ⅰ组(生理盐水NS)；对照Ⅱ组(NS)；高血粘度Ⅰ组(高分子右旋糖酐，High Molecular Dextran，HMD)；高血粘度Ⅱ组(HMD)。

2.高血粘度模型制备：

高血粘度Ⅰ组：尾静脉缓慢注射10％高分子右旋糖酐溶液(瑞士Amersham Biosciences公司)，20mL/kg，每天1次，连续3d。

高血粘度Ⅱ组：尾静脉缓慢注射10％高分子右旋糖酐溶液(瑞士Amersham Biosciences公司)，20mL/kg，每天1次，连续6d。

3.血粘度的检测：所有动物于最后一次注射后20min，摘眼球取血，肝素抗凝检测全血粘度，验证是否成功造模。

4.统计学处理：实验数据以表示，采用SPSS8.0统计软件，用t检验进行两组间血粘度的显著性检验，P＜0.05为显著性标准。

3.实验过程和结果

高血粘度模型大鼠随机分为3组，即model、AZM、AZMFF(分别表示不予治疗的模型组、单独使用阿奇霉素组、阿奇霉素与妇科千金片全方合并组)。

Model：不予治疗的模型组。

AZM：阿奇霉素联合治疗模型组。

AZMFF：阿奇霉素+妇科千金片(主要成分为千斤拔、穿心莲、金樱根、功劳木、单面针、当归、鸡血藤、党参，株洲千金药业股份有限公司出品)联合治疗模型组。

(1)受试剂量

A.AZM剂量：本实施例对阿奇霉素(AZM)的可选受试剂量进行了分析和确定，目的为选择一个试用后作用强度适中、时长适中的受试剂量，同时明确同中药合并用药时的时程长度。预试60、30、20、10mg/kg.d三天，发现原设定剂量过高，最终采用10mg/kg.d。

B.受试药物剂量：

原设定妇科千金方全方(AZMFF)为2.058g/kg.d，但预试发现，此剂量采用最大给容积配制的给药液为稀浆状，无法通过灌胃针头。随调整最终全方AZMFF给药剂量为最大给药量1.66g/kg.d。

(2)给药时间

除空白和模型外，造模后第六日开始给予相应药物。AZM与各中药分别给予，相差时间约2小时。所有给药组在8点左右均先给予相应剂量的AZM，两个小时后开始给予相应的中药生理盐水水混物。

(3)样本收集

第1日给予AZM两小时后，经尾静脉采集各组大鼠末梢静脉血。从第二日始各给药组大鼠每日两次采血，于给予阿奇前和给予中药前各经尾静脉采集一次，每次采集血量约0.3mL，取样时间误差约30min。于给药第2、4、6、8日给予22AZM两小时后，各组麻醉后牺牲约2～4只大鼠，采集下腔动脉抗凝全血。

(4)送样测试

所有时间点0.3mL及末次全血，末次抗凝全血送检血细胞计数、血流变。实验效果标准：

1.显效：用药后全血粘度降至正常范围者。

2.有效：全血粘度较前下降至接近参考值。

3.无效：血粘度下降不明显者。

Model和AZM的各20例中，显效0例，占0％；有效0例，0％；无效20例，占100％；总有效率为0％。AZMFF 20例中，显效5例，占25％；有效12例，60％；无效3例，占15％；总有效率为85％。