瓜蒌皮注射液中化学成分的制备方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物领域，具体涉及瓜蒌皮注射液中化学成分的制备方法及其用途。
【背景技术】
[0002] 瓜蒌(拉丁学名：Trichosantheskirilowii Maxim.)的根（中药名天花粉）、果肉 (中药名栝楼实）、果皮（中药名栝楼皮）、种子（中药名栝楼仁)都是有名的中药。其中瓜蒌皮 被做成注射液(瓜蒌皮注射液，上海上药第一生化药业有限公司），凭其优良的品质和疗效， 在国内被广泛用于心绞痛，冠心病等。
[0003] 作为一种常见中药，瓜蒌皮化学成分非常复杂，其真正有效成分至今没有明确，现 有文献公开了 一些瓜蒌皮化学成分，如:《瓜蒌果皮化学成分》（山东中医药大学博士学位论 文，李爱峰，2011)对瓜蒌皮化学成分进行了详尽的综述和分析，在做水溶性化学成分分离 时，其选用826型树脂分离得到极性相对较小的化合物;李爱峰等人的专利:一种从瓜蒌皮 中分离纯化4种核苷类化学成分的方法(CN103304613A)、一种从瓜蒌皮中分离纯化5种嘌呤 及嘧啶碱基的方法（CN103304490A)、一种从瓜蒌皮中分离纯化3种黄酮苷的方法（CN 103304611 A)等通过反相制备液相色谱，也对瓜蒌皮化学成分进行了研究。然而，上述文献 所用方法与瓜蒌皮注射液工业化制备工艺相去甚远，因而上述文献方法分离得到的化合物 不能反映瓜蒌皮注射液的真实化学成分；另外，上述文献在反相柱层析前没有进行有效除 糖和除色素操作，而瓜蒌中含有丰富的糖类和色素，会对色谱柱造成不可逆损坏，因此，该 类方法不适用于工业化生产，且重复性差。
[0004] 作为一种中药注射液，也有许多文献对瓜蒌皮注射液化学成分进行过报道，瓜蒌 皮注射液及其制备方法（专利CN1460493A)对瓜蒌皮注射液的生产工艺进行了描述：1、水 提，2、75 %乙醇沉淀，3、阳离子树脂分离，收集目标段馏分，进行浓缩即得瓜蒌皮注射液原 液，明确说明了所得原液中主要成分为氨基酸。瓜蒌皮或瓜蒌皮注射液的液相指纹图谱测 试方法(专利CN101059482A)对瓜蒌皮注射液的指纹图谱进行了公开和说明，作者用柱前衍 生法对瓜蒌皮注射液中的主要氨基酸进行了控制。现有文献对瓜蒌皮注射液的化学成分研 究还局限在氨基酸类成分。
[0005] 瓜蒌皮注射液应用越来越广泛，对其化学成分的分离和鉴定具有十分重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种瓜蒌皮注射液中化学成分的制备方法及其用途。本发明 的方法可以从瓜娄皮中同时制备腺苷、香叶木素-7-〇-0_D-匍萄糖苷、芦丁，并且提供了以 腺苷、香叶木素-7-〇-i3-D_葡萄糖苷、芦丁为对照品控制瓜蒌皮注射液质量的方法。本发明 的方法简单易行，重复性好，环保安全。
[0007] 本发明利用正相柱层析法对瓜蒌皮注射液中氨基酸进行分离时，意外发现水不溶 性沉淀。对该沉淀重结晶，并进行结构鉴定，确定为香叶木素-7-〇-i3_D-葡萄糖苷。本发明对 柱层析方法优化，并进行进一步反相色谱柱分离，最终又得到化合物腺苷和芦丁。由于本发 明进行反相层析前已用正相柱除去色素和糖类，故本发明可大量制备腺苷和芦丁，为后续 的质量控制提供充足的原料。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现上述目的的：
[0009] 本发明提供瓜蒌皮注射液中化学成分的制备方法，其包括下述步骤：
[0010] (1)将瓜蒌皮注射液浓缩物与硅胶混合拌样，然后进行硅胶正相柱层析，先用体积 比为甲醇:二氯甲烷=1: (3~4)作为洗脱剂进行洗脱，然后用体积比为甲醇:二氯甲烷=1: (1~1.5)作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到层析物；
[0011] (2)将步骤（1)得到的层析物与甲醇混合，室温搅拌，降温至0~4°C，过滤，得滤液 a，滤饼与水混匀后过滤得到滤液b，将滤液a与滤液b合并浓缩即得浓缩物；
[0012] (3)将步骤(2)所得的浓缩物采用高压制备液相色谱进行纯化，色谱条件如下：百 分比为体积百分比；
[0014]收集IOmin~I Imin的洗脱液，减压浓缩即得腺苷。
[0015] 其中，所述的瓜蒌皮注射液浓缩物是指将瓜蒌皮注射液减压浓缩至无液滴滴下得 到的物质。
[0016] 其中，所述的瓜蒌皮注射液可为本领域常规的瓜蒌皮注射液，较佳地通过下述步 骤制得:将瓜蒌皮与水混合后，常压下回流提取3~4次，合并提取液;减压浓缩，加入质量百 分比浓度为90%~95%的乙醇，加至乙醇质量百分比为70%~75%，静置，过滤，得上清液； 上清液上阳离子交换树脂柱，用水洗涤，然后用氨水作为洗脱剂进行洗脱，将洗脱液用酸调 节pH至3.5~4，冷藏过夜，过滤即得瓜蒌皮注射液。
[0017] 其中，所述的减压浓缩较佳地为减压浓缩至瓜蒌皮的原料重量的0.75~2倍。
[0018] 其中，所述的阳离子交换树脂柱中的阳离子交换树脂较佳地为购自于上海树脂厂 的732型强酸性阳离子交换树脂。
[0019] 其中，所述的水较佳地为去离子水。
[0020] 其中，所述的氨水的浓度较佳地为1~2mol/L。
[0021 ]其中，所述的冷藏的温度较佳地为0~3°C。
[0022] 其中，步骤（1)中，瓜蒌皮注射液浓缩物与硅胶混合拌样中，所述的瓜蒌皮注射液 浓缩物与所述的硅胶的质量比较佳地为1: (1~2)。
[0023] 其中，步骤（1)中，硅胶正相柱层析中，所述的硅胶的用量为较佳地瓜蒌皮注射液 浓缩物质量的5~20倍。
[0024] 其中，步骤（1)中，所述的用体积比为甲醇:二氯甲烷=1: (3~4)作为洗脱剂进行 洗脱较佳地为洗脱3~5个柱体积。
[0025] 步骤(1)中，所述的硅胶的目数较佳地为100~200目。
[0026] 步骤（1)的柱层析不仅能将目标化合物进行富集，还能将吸附性较大的色素和糖 类化合物保留在硅胶柱上，以免损坏后面操作中的反相色谱柱。
[0027] 步骤(2)中，所述的层析物与甲醇的质量比较佳地为1: (100~150)。
[0028] 步骤(2)中，所述的甲醇较佳地为无水甲醇。
[0029]步骤(2)中，所述的水较佳地为50~80°C的热水。
[0030]步骤(3)中，高压制备液相色谱中，洗脱剂的流速较佳地为70~90mL/min，检测波 长较佳地为254nm〇
[0031] 本发明还提供了腺苷作为对照品在检测药品中腺苷含量的应用。
[0032] 其中，所述的药品较佳地为瓜蒌皮注射液。
[0033]其中，所述的应用较佳地包括下述步骤:将瓜蒌皮注射液和腺苷对照品溶液分别 进行高效液相色谱检测，根据腺苷对照品色谱图的保留时间确定瓜蒌皮注射液中相关物质 的峰，并根据峰面积计算瓜蒌皮注射液中腺苷的含量。
[0034]其中，所述的腺苷对照品溶液的浓度较佳地为0.3mg/mL。
[0035] 其中，所述的瓜蒌皮注射液即为前述制备方法制得的瓜蒌皮注射液。
[0036] 其中，所述的高效液相色谱的条件优选如下:色谱柱为十八烷基键合硅胶色谱柱， 进样量为20yL，洗脱条件如下：
[0038] 。
[0039] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0040] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0041 ]本发明的积极进步效果在于：
[0042] (1)本发明首次从瓜蒌皮注射液中发现并分离纯化出单体化合物:腺苷。
[0043] (2)本发明还发现了一种检测方法，可以以腺苷为对照品对瓜蒌皮注射液中的腺 苷进行检测和控制。研究发现，五批次注射液中，该化合物含量稳定均一，说明本发明分离 得到的化合物腺苷可以作为瓜蒌皮注射液质量控制的一个指标。
【附图说明】
[0044] 图1为实施例4制得的香叶木素-7-Ο-β-D-葡萄糖苷的HPLC色谱图。
[0045]图2为实施例5制得的腺苷的HPLC色谱图。
[0046]图3为实施例5制得的芦丁的HPLC色谱图。
【具体实施方式】
[0047]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0048] 实施例1瓜蒌皮注射液原液制备
[0049] 将5kg瓜蒌皮切成小块后，加入25L去离子水，常压下回流提取3次，每次2小时，合 并提取液。将所得提取液浓缩至l〇kg，趁热加入90%乙醇，加至含醇量为75%，常温放置48 小时，使其充分沉淀。过滤取上清液。将所得上清液浓缩至5L，回收乙醇。5L浓缩液上732型 阳离子交换树脂柱（其树脂购自上海树脂厂的强酸性阳离子树脂，装入直径40cm长度1.5m 的色谱柱，用25L蒸馏水预洗，流速为500mL/min)，吸附有效成分，弃去流出液，上样结束后 用50L去离子水洗涤，然后用1.5mol/L的氨水作为洗脱剂洗脱，富集氨基酸类化合物，浓缩 除氨后加注射用水至1L，用盐酸调pH至3.5-4,0°C冷藏过夜，过滤即得瓜蒌皮注射液原液 IL0
[0050] 同上法制得瓜蒌皮注射液原液20L，取该原液20L减压浓缩至无液滴滴下，得瓜蒌 皮注射液浸膏350g。
[0051] 实施例2柱层析富集目标化合物
[0052] 取瓜蒌皮注射液浸膏100g，与购自青岛海洋化工有限公司的100-200目硅胶200g 拌样，另取1.5kg青岛海洋化工有限公司的100-200目硅胶装柱，硅胶柱规格为直径12公分， 长度1.0米。选用国药集团化学试剂有限公司的分析纯甲醇、二氯甲烷作为洗脱剂，进行柱 层析洗脱。
[0053] 甲醇：二氯甲