烷(体积比）=1:3先洗脱4个柱体积，弃去洗脱液。换用甲醇：二氯甲 烷(体积比）=1:1洗脱，收集洗脱液，并以芦丁为对照品用薄层层析监控，待芦丁所显示斑 点变淡后，结束收集，共收集洗脱液6L，减压浓缩除去收集液中的溶剂得层析物0. Sg。
[0054] 实施例3柱层析富集目标化合物
[0055]取瓜蒌皮注射液浸膏150g，用购自青岛海洋化工有限公司的100-200目硅胶200g 拌样，另取1.5kg青岛海洋化工有限公司的100-200目硅胶装柱，硅胶柱规格为直径12公分， 长度1.0米。选用国药试剂的分析纯甲醇、二氯甲烷作为洗脱剂，进行柱层析洗脱。
[0056] 甲醇：二氯甲烷(体积比）=1:3先洗脱5个柱体积，弃去洗脱液。换用甲醇：二氯甲 烷=1:1(体积比），收集洗脱液，并以芦丁为对照品用薄层层析监控，待芦丁所显示斑点变 淡后，结束收集，共收集洗脱液8L，减压浓缩除去收集液中的溶剂得层析物l.Og。
[0057] 实施例4重结晶分离纯化香叶木素-7-0-?Η)_葡萄糖苷
[0058] 取按实施例2和3制得的层析物2.5g，加入国药集团化学试剂有限公司的分析纯甲 醇500mL，室温下搅拌10分钟，然后降温至0°C，静置12小时后过滤，滤液收集备用。滤饼用80 °〇热水混匀，搅拌10分钟后趁热过滤，得到固体物25mg，经HPLC检测纯度为98% (见图1所 示），核磁鉴定(AvanceIH600MHz Bruker)(为香叶木素-7-〇-0-D-葡萄糖苷，同时将收集得 到的滤液合并。
[0059] 所得香叶木素-7-〇-0-D-葡萄糖苷核磁数据如下= 1H-NmrHOOMHz，DMS〇-d6)Sppm: 12.97(lH,s),10.01(lH,br),7.61(2H,m),7.00(lH,s),6.95(lH,d,J=5.6Hz),6.88(lH,d, J=lHz),6.45(lH,d ,J=lHz),5.41(lH,d ,J = 3.2Hz),5.15(lH,d ,J = 3.2hz),5.08(2H,m), 4.64(lH，m)，3.90(3H，s) ,3.卜3.7(6!1，111)。13(：-匪1?(10冊!^，0150-(16)3??111 :182.5，164.6， 163.5,161.5,157.4,151.4,148.5,121.8,120.9,116.3,110.8,105.8,103.9,100.5,99.9， 95.5,77.7,76.9,73.6,70.1，61.0,56.5。
[0060] 实施例5反相高压色谱制备腺苷和芦丁
[0061] 将实施例4过滤的滤液减压浓缩，选用VARIAN prostar SD-I制备液相系统进行制 备，选用2英寸色谱柱，按以下条件进行制备：
[0063] 收集IOmin-I Imin的洗脱液，减压浓缩得化合物腺苷208mg，经HPLC检测纯度为 99% (见图2所示）；收集21min-22min的洗脱液，减压浓缩即得化合物芦丁35mg，经HPLC检测 纯度为99 % (见图3所示）。
[0064] 所得芦丁核磁数据如下（AvanceHI600MHz Bruker): 1H-MVtR(SOC)MHz，DMS0_d6)3 ppm：12.61(lH,s),10.70(lH,br s),9.55(lH,br s),7.55(1H,s),7.53(1H,s),6.84(1H, s)，6.39(lH,s)，6.19(lH，s) ,5.34(2H,m) ,4.39(lH,s) ,1.0(3H，d J = 5.6Hz)</3C-匪R (100MHz，DMS0-d6)Sppm :177.3，164.0，161.1，156.5，156.3，148.3，144.6，133.2，121.5， 116·2，115·1，1·3·9，101·1，100·6,98·6,93·5,76·4,75·8,74·0,71·8,70·5,70·3,69·9， 68.1,66.9,17.6〇
[0065] 所得腺苷核磁数据如下（AvanceIII400MHz Bruker): 1H-MflUeOOMHz^MSO-(I6)S ppm:8.36(lH，s，2-H)，8· 14(lH，s，8-H)，5.88(lH，d，J = 6.4Hz，l'-H)，4.61(lH，t，J = 5.6Hz,2，-H),4.15(lH,m,3，-H),4.11(lH,m,3 ，-H)〇13C-NMR(150MHz,DMS0-d6)5ppm：156.6, 152.8,149.6,140.4,119.9,88.4,86.4,73.9,71.I,61.2〇
[0066] 实施例6以腺苷、香叶木素-7-〇-i3_D-葡萄糖苷、芦丁为对照品进行瓜蒌皮注射液 质控
[0067] 精密配制腺苷浓度为0.3mg/mL水溶液、香叶木素 -7-(H3-D-葡萄糖苷0.3mg/mL水/ 乙醇(体积比1:1)溶液和芦丁〇.3mg/mL甲醇溶液作为对照品，供试品选用五个批次瓜蒌皮 注射液(上海上药第一生化药业有限公司），色谱条件如下：色谱柱选用十八烷基键合硅胶 Diamonsil ,Cl8(4.6 X 250mm，5μηι)，洗脱条件如下：
[0069] ~供试品与对照品按上述条件各进样20yL，根据对照品腺苷、香叶木素-7-〇-0-〇-葡_ 萄糖苷、芦丁的峰的保留时间确定供试品中对应物质及其含量。经测定五个批次的瓜蒌皮 注射液中腺苷、香叶木素-7-0-?Η)_葡萄糖苷、芦丁的含量稳定，且符合标准。如下表所示：
[0070]
【主权项】
1. 瓜萎皮注射液中化学成分的制备方法，其包括下述步骤： (1) 将瓜萎皮注射液浓缩物与硅胶混合拌样，然后进行硅胶正相柱层析，先用体积比为 甲醇:二氯甲烧= 1:(3~4)作为洗脱剂进行洗脱，然后用体积比为甲醇:二氯甲烧=1:(1~ 1.5)作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到层析物； (2) 将步骤（1)得到的层析物与甲醇混合，室溫揽拌，降溫至0~4°C，过滤，得滤液a,滤 饼与水混匀后过滤得到滤液b，将滤液a与滤液b合并浓缩即得浓缩物； (3) 将步骤(2)所得的浓缩物采用高压制备液相色谱进行纯化，色谱条件如下：百分比 为体积百分比；收集lOmin~1 Imin的洗脱液，减压浓缩即得腺巧。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的瓜萎皮注射液通过下述步骤制 得:将瓜萎皮与水混合后，常压下回流提取3~4次，合并提取液;减压浓缩，加入质量百分比 浓度为90%~95%的乙醇，加至乙醇质量百分比为70%~75%，静置，过滤，得上清液;上清 液上阳离子交换树脂柱，用水洗涂，然后用氨水作为洗脱剂进行洗脱，将洗脱液用酸调节pH 至3.5~4，冷藏过夜，过滤即得瓜萎皮注射液。3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的减压浓缩为减压浓缩至瓜萎皮的 原料重量的0.75~2倍； 和/或，所述的阳离子交换树脂柱中的阳离子交换树脂为购自于上海树脂厂的732型强 酸性阳离子交换树脂； 和/或，所述的水为去离子水； 和/或，所述的氨水的浓度为1~2mo 1 /1; 和/或，所述的冷藏的溫度为0~3°C。4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中，瓜萎皮注射液浓缩物与硅胶 混合拌样中，所述的瓜萎皮注射液浓缩物与所述的硅胶的质量比为1: (1~2)。5. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中，硅胶正相柱层析中，所述的 硅胶的用量为瓜萎皮注射液浓缩物质量的5~20倍； 和/或，步骤（1)中，所述的用体积比为甲醇:二氯甲烧=1:(3~4)作为洗脱剂进行洗脱 为洗脱3~5个柱体积； 和/或，步骤(1)中，所述的硅胶的目数为100~200目。6. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的层析物与甲醇的质量 比为 1:(100 ~150); 和/或，步骤(2)中，所述的甲醇为无水甲醇； 和/或，步骤(2)中，所述的水为50~80°C的热水； 和/或，步骤(3)中，高压制备液相色谱中，洗脱剂的流速为70~90mL/min，检测波长为 254nm〇7. 腺巧作为对照品在检测药品中腺巧含量的应用。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药品为瓜萎皮注射液。9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用包括下述步骤:将瓜萎皮注射液 和腺巧对照品溶液分别进行高效液相色谱检测，根据腺巧对照品色谱图的保留时间确定瓜 萎皮注射液中相关物质的峰，并根据峰面积计算瓜萎皮注射液中腺巧的含量。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的腺巧对照品溶液的浓度为0.3mg/mL; 和/或，所述的高效液相色谱的条件如下：色谱柱为十八烷基键合硅胶色谱柱，进样量 为20yL，洗脱条件如下：
【专利摘要】本发明公开了瓜蒌皮注射液中化学成分的制备方法及其用途。该制备方法包括下述步骤：(1)将瓜蒌皮注射液浓缩物与硅胶混合拌样，然后进行硅胶正相柱层析，先用体积比为甲醇：二氯甲烷＝1:(3～4)作为洗脱剂进行洗脱，然后用体积比为甲醇：二氯甲烷＝1:(1～1.5)作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得到层析物；(2)将层析物与甲醇混合，室温搅拌，降温至0～4℃，过滤，得滤液a，滤饼与水混匀后过滤得到滤液b，将滤液a与滤液b合并浓缩即得浓缩物；(3)将浓缩物采用高压制备液相色谱进行纯化，即得腺苷。本发明的制备方法得到的化合物含量稳定均一，可以作为瓜蒌皮注射液质量控制的一个指标。
【IPC分类】C07H17/07, C07H1/06, C07H19/167, G01N30/02
【公开号】CN105541944
【申请号】CN201610118555
【发明人】袁永雷, 陈辰, 黄臻辉
【申请人】上海上药第一生化药业有限公司
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年3月2日